楊 靜,許明君,王釔力,衷敬華
(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科,江西贛州 341000)
鼻咽癌是臨床常見(jiàn)的一種頭頸惡性腫瘤,多起源于鼻咽黏膜上皮,在我國(guó)東南部地區(qū)發(fā)病率較高,臨床表現(xiàn)為鼻塞、耳鳴、聽(tīng)力下降、頸部淋巴結(jié)增大及頭痛等癥狀[1]。通過(guò)手術(shù)及放化療等方法治療鼻咽癌,可有效提高患者5年生存率,但放化療對(duì)患者正常組織細(xì)胞具有損傷作用,易引起毒性反應(yīng),影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量[2]。我國(guó)應(yīng)用中藥防治鼻咽癌具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好抗鼻咽癌效果,安全有效,不良反應(yīng)發(fā)生率低[3-4]。千金藤堿是從防己科千金藤屬植物中提取的一種生物堿,具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用,在腫瘤實(shí)驗(yàn)中顯示出廣泛抗腫瘤活性,對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期具有阻滯作用,并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗癌作用[5]。以往千金藤堿相關(guān)研究多集中于細(xì)胞水平,而其在動(dòng)物體內(nèi)抗鼻咽癌作用鮮有報(bào)道,本研究通過(guò)建立鼻咽癌大鼠模型,探討千金藤堿對(duì)鼻咽癌大鼠的防治作用及機(jī)制,以期為臨床防治鼻咽癌提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠60只,SPF級(jí),7周齡,體質(zhì)量(200±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。大鼠購(gòu)入后保持環(huán)境溫度20~25 ℃,相對(duì)濕度45%~65%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。
1.2 藥物、主要試劑和儀器二亞硝基哌嗪(dinitrosopiperazine, DNP)(美國(guó)Sigma公司),佛波醇酯(廣州源生醫(yī)藥科技有限公司),鹽酸千金藤堿(≥98%,青島捷世康科技有限公司),細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)、特異性激活劑鼠源表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)(美國(guó)Accurate Chemical公司),ERK抑制劑SCH772984(美國(guó)Adooq Bioscience公司),大鼠白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒(武漢博世康生物工程有限公司),兔抗大鼠ERK1/2多抗、p-ERK1/2多抗、存活素(Survivin)多抗、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)多抗(美國(guó)CST公司),兔抗大鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma /leukemia-2, Bcl-2)單抗、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)單抗、山羊抗兔IgG-HRP(英國(guó)Abcam公司);微量蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司),ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司),CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。
1.3 建模及分組干預(yù)建立鼻咽癌大鼠模型[6]:取60只大鼠,按15 mg/kg體質(zhì)量腋下皮下注射DNP,同時(shí)按100 mg/kg體質(zhì)量注射促癌劑佛波醇酯,3 d注射1次,每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量,調(diào)整用藥量,連續(xù)注射90 d,共30次。建模大鼠隨機(jī)分為模型組、千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組(n=15),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剔除死亡及病理切片觀察造模不成功大鼠后,各組分別最終剔除7、4、2、2只大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。另取10只大鼠為對(duì)照組,腋下注射等體積生理鹽水。建模開(kāi)始后,千金藤堿組按10 mg/kg體質(zhì)量灌胃千金藤堿,每天1次,腹腔注射生理鹽水,每周1次;激動(dòng)劑組和抑制劑組按10 mg/kg體質(zhì)量灌胃千金藤堿,每天1次,按25 mg/kg體質(zhì)量分別腹腔注射ERK特異性激活劑EGF和抑制劑SCH772984,1次/周;對(duì)照組和模型組灌胃和腹腔注射生理鹽水,干預(yù)頻次同上,連續(xù)90 d。
1.4 檢測(cè)鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18水平干預(yù)期間,觀察大鼠一般情況。末次干預(yù)12 h后,采用10 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥固定,消毒頸部皮膚行氣管切開(kāi)術(shù),于氣管后部插入1根直徑約2 mm的聚乙烯管供大鼠呼吸,另向上插一根管至鼻咽部,封閉鼻腭通道,使用微量蠕動(dòng)泵罐洗鼻腔,1 mL/min,共灌洗5 min,收集5 mL鼻腔灌洗液,4 ℃離心15 min,取上清。采用ELISA法檢測(cè)灌洗液中IL-1β、IL-18水平,用酶標(biāo)儀在450 nm讀取吸光度(A)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品IL-1β、IL-18含量并進(jìn)行組間比較。
1.5 HE染色觀察鼻黏膜病理變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠,分離上頜骨,沿鼻中線切開(kāi),暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔,取鼻中隔及其黏膜組織,一部分放入40 g/L多聚甲醛中固定,另一部分鼻黏膜保存于液氮中。組織固定后常規(guī)制作石蠟切片,片厚約5 μm,進(jìn)行HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜病理學(xué)變化。
1.6 TUNEL法觀察鼻黏膜細(xì)胞凋亡情況取鼻黏膜石蠟切片,脫蠟至水,二甲苯透明,梯度乙醇脫水;蛋白酶K室溫修復(fù)15 min,PBS 5 min×3次;30 mL/L過(guò)氧化氫37 ℃封閉10 min,按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算并觀察細(xì)胞凋亡程度[細(xì)胞凋亡率(%)=棕色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%]。
1.7 Western blotting檢測(cè)鼻黏膜中ERK1/2、p-ERK1/2、Survivin、XIAP、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)取液氮中保存鼻黏膜組織60 mg,加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,BCA法測(cè)定蛋白濃度。變性后,取50 μg蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST溶液洗膜,加入一抗(ERK、p-ERK、Survivin和XIAP及內(nèi)參β-actin稀釋比例為1∶1 000,Bcl-2和Bax為1∶500),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST溶液洗膜,放入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶4 000),室溫孵育2 h,TBST溶液洗膜,ECL顯影,采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。以目的蛋白與β-actin的比值表示各蛋白相對(duì)表達(dá),并進(jìn)行組間比較。
2.1 各組大鼠的一般情況對(duì)照組大鼠皮毛光亮,表現(xiàn)活潑,飲食飲水正常;模型組大鼠毛色暗黃,精神萎靡,活動(dòng)量減少,打噴嚏及撓鼻動(dòng)作不止,流鼻涕,鼻咽部出現(xiàn)潰瘍或腫物;千金藤堿組大鼠毛色光亮,活動(dòng)量較模型組有所增加,精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn),打噴嚏及撓鼻動(dòng)作明顯減少;激活劑組大鼠精神狀態(tài)及活動(dòng)與模型組相似,多次撓鼻、流涕、打噴嚏,鼻咽部發(fā)生潰瘍或腫物;抑制劑組大鼠活潑好動(dòng),偶有打噴嚏及撓鼻動(dòng)作,精神狀態(tài)接近對(duì)照組。
大鼠組間體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠體質(zhì)量均較對(duì)照組減小(P<0.05);與模型組比較,千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05);與千金藤堿組比較,激活劑組大鼠體質(zhì)量減小,抑制劑組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05);抑制劑組大鼠體質(zhì)量大于激活劑組(P<0.05,表1)。
表1 各組大鼠體質(zhì)量的比較
2.2 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-1β與IL-18水平變化各組IL-1β、IL-18水平較對(duì)照組升高(P<0.05);與模型組比較,千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組IL-1β、IL-18水平降低(P<0.05);與千金藤堿組比較,激活劑組IL-1β、IL-18水平升高,抑制劑組水平降低(P<0.05);抑制劑組IL-1β、IL-18水平低于激活劑組(P<0.05,表2)。
表2 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-1β與IL-18水平的比較
2.3 HE染色觀察鼻黏膜病理學(xué)變化HE染色顯示,對(duì)照組細(xì)胞層次清晰,形態(tài)規(guī)則,大小均勻,排列整齊;模型組細(xì)胞層次增多,癌變細(xì)胞增多,細(xì)胞形態(tài)及排列不規(guī)則;千金藤堿組局部細(xì)胞增多,形態(tài)較規(guī)則,癌變細(xì)胞減少;激活劑組細(xì)胞層次不清,形態(tài)不規(guī)則,較模型組稍有改善,但較千金藤堿組差;抑制劑組細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組,排列較整齊,細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則(圖1)。
圖1 各組大鼠鼻黏膜病理學(xué)變化
2.4 各組大鼠鼻黏膜的細(xì)胞凋亡情況各組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高(P<0.05);千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組細(xì)胞凋亡較模型組降低(P<0.05);與千金藤堿組比較,激活劑組細(xì)胞凋亡率升高,抑制劑組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);抑制劑組細(xì)胞凋亡率低于激活劑組(P<0.05,圖2)。
圖2 各組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞的凋亡情況
2.5 各組大鼠鼻黏膜相關(guān)蛋白的表達(dá)情況與對(duì)照組比較,模型組、千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組p-ERK1/2、Bax蛋白表達(dá)升高,Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,千金藤堿組、激活劑組和抑制劑組p-ERK1/2、Bax蛋白表達(dá)降低,Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與千金藤堿組比較,激活劑組p-ERK1/2、Bax蛋白表達(dá)升高,Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,抑制劑組p-ERK1/2、Bax蛋白表達(dá)降低,Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);抑制劑組p-ERK1/2、Bax蛋白表達(dá)低于激活劑組,Survivin、XIAP、Bcl-2蛋白表達(dá)高于激活劑組(P<0.05);各組ERK蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。
圖3 Western blotting檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜組織相關(guān)蛋白的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
鼻咽癌病因復(fù)雜,與遺傳、EB病毒感染以及環(huán)境等因素有關(guān),而放化療綜合治療較單純放療可明顯提高治療效果。由于鼻咽癌病理類(lèi)型、解剖結(jié)構(gòu)特殊,加之腫瘤細(xì)胞增殖較快,長(zhǎng)期放療易產(chǎn)生不良反應(yīng)及放療抵抗,導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生存率[7-8]。如何減輕不良反應(yīng),減少放療對(duì)患者的不良反應(yīng),尋找低毒安全的藥物對(duì)臨床防治鼻咽癌具有積極意義。隨著鼻咽癌研究的深入,千金藤堿等多種中藥單體在預(yù)防鼻咽癌發(fā)生、增強(qiáng)放療敏感性以及減輕放化療毒副作用方面均顯示出良好效果。
腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程,IL-1β和IL-18為重要促炎因子,參與機(jī)體免疫應(yīng)答及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。研究顯示,鼻咽癌患者體內(nèi)IL-1β
與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與千金藤堿組比較,△P<0.05;與激活劑組比較,◇P<0.05。
等多種炎癥因子水平升高,外周血炎癥因子水平對(duì)復(fù)發(fā)鼻咽癌患者預(yù)后生存期有重要影響,IL-1β和IL-18水平升高可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞作用,使鼻咽癌病情惡化[9-10]。千金藤堿的抗腫瘤活性已被證實(shí),可抑制裸鼠原位肝癌向腎臟及睪丸轉(zhuǎn)移,并可阻滯乳腺癌細(xì)胞癌細(xì)胞停留在G0/G1期,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[11-12]。RATTANAWONG等[13]研究表明,千金藤堿對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞也具有抗癌活性。本研究結(jié)果顯示,千金藤堿組大鼠較模型組精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),體質(zhì)量增加,鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18水平降低,且鏡檢鼻腔黏膜病理狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),細(xì)胞凋亡率降低,提示千金藤堿對(duì)鼻咽癌大鼠具有防癌抗癌作用,可明顯改善鼻咽癌大鼠撓鼻等癥狀,減輕炎癥反應(yīng),保護(hù)鼻黏膜。
絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)/ERK信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生物學(xué)過(guò)程,通過(guò)調(diào)控下游細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,該通路異常激活與乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。ERK1/2是MAPK通路的關(guān)鍵蛋白之一,經(jīng)磷酸化活化后激活通路,參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,其表達(dá)下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Survivin屬于抗凋亡蛋白,可促進(jìn)細(xì)胞增殖,其在腫瘤組織中的表達(dá)程度與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。XIAP在人體內(nèi)廣泛存在,屬于凋亡抑制因子,可通過(guò)抑制Caspase途徑抑制細(xì)胞凋亡。原位癌基因Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡,Bax可與Bcl-2結(jié)合為二聚體阻止其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MAPK/ERK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax表達(dá),參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程[16-17]。本研究結(jié)果顯示,千金藤堿可減少鼻黏膜細(xì)胞凋亡,且ERK磷酸化被抑制,提示千金藤堿可能參與調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路。為驗(yàn)證千金藤堿對(duì)ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用,本研究在使用千金藤堿干預(yù)的基礎(chǔ)上同時(shí)使用ERK特異性激活劑EGF和抑制劑SCH772984,結(jié)果顯示,激活劑組p-ERK表達(dá)升高,而抑制劑組p-ERK表達(dá)降低,并影響下游Survivin、XIAP及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá),同時(shí)激活劑組千金藤堿對(duì)鼻黏膜的保護(hù)作用降低,而抑制劑組則升高,提示千金藤堿可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路,發(fā)揮抗癌作用。
綜上所述,千金藤堿對(duì)鼻咽癌大鼠具有一定防治作用,其可能是通過(guò)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路,減輕炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,保護(hù)鼻黏膜,發(fā)揮抗癌作用,為臨床防治鼻咽癌提供一定理論依據(jù)。
西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2021年4期