黃尚軍，黃筱然，陳國娜，楊航真，李 欣，4

［1.華南理工大學醫(yī)學院，廣州 510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）全科醫(yī)學科，廣州 510100；3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006；4.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）急診科，廣州 510100］

主動脈夾層（aortic dissection，AD）是各種原因引起的主動脈內膜中膜撕裂，可導致血液流入將主動脈分隔成真腔和假腔。AD 的病理學特征性改變是主動脈中膜血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）丟失和細胞外基質降解［1］。AD 的發(fā)生、發(fā)展與VSMCs 的狀態(tài)和功能密切相關，AD 患者的主動脈中分泌型VSMCs 增多，收縮型VSMCs 減少［2-4］。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)包括環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CPFX）在內的氟喹諾酮類藥物可增加AD 的發(fā)病風險［5-9］。CPFX 是一種人工合成的第三代氟喹諾酮類藥物，通過抑制細菌DNA 拓撲異構酶IV 和DNA 回旋酶發(fā)揮抗菌作用，具有抗菌譜廣、抗菌作用強的特點，臨床應用廣泛。一項關于CPFX 增加小鼠AD 易感性的研究發(fā)現(xiàn)，單用CPFX 僅能擴張主動脈內徑，不能顯著增加AD 發(fā)生率和破裂率，在高脂飲食和血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）構建的AD 小鼠模型中加入CPFX 后，AD 發(fā)生率和破裂率顯著升高［10］。雖然目前有關于CPFX 增加AD 發(fā)病風險的研究，但其機制研究尚未完全闡明。因此，本研究旨在通過體外實驗探討CPFX 是否通過VSMCs 表型轉換導致AD 發(fā)病風險增加。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究使用的VSMCs 來源于器官捐獻患者的主動脈組織，標本收集遵循的程序符合廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）醫(yī)學倫理委員會所制訂的倫理學標準并得到該委員會批準（No.GDREC2018060H），且患者家屬簽署有知情同意書，對本研究知情同意。倒置顯微鏡（Nikon，日本）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）；平滑肌肌動蛋白α（αsmooth muscle actin，α-SMA）（Ab5694）、平滑肌蛋白22（smooth muscle 22，SM22）（Ab10135）、類肌鈣蛋白（calponin）（Ab46794）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyc?eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Ab9485）、Ki-67（Ab15580）均購自美國Abcam公司；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）（BS1264）購自美國bio?world公司；電泳儀購自美國Bio-RAD公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和Ang Ⅱ購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；CPFX購自中國麥克林公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自中國愛爾蘭Millipore 公司；Tris 緩沖液（tris buffered saline，TBS）購自中國博士德公司，吐溫-20 購自中國索萊寶公司，電化學發(fā)光（electrochemilumines?cence，ECL）底物試劑盒購自中國Biosharp公司。

1.2 組織貼壁法分離培養(yǎng)血管平滑肌細胞方法

取手術切除的供體來源的新鮮主動脈血管，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗血管表面的血液后于超凈工作臺內鈍性分離主動脈內膜、中膜、外膜。將主動脈中膜組織剪成2 mm×2 mm 的碎塊，并將碎塊均勻地平鋪于培養(yǎng)瓶內，倒置于二氧化碳培養(yǎng)箱中2 h，待組織塊自然貼壁后翻轉培養(yǎng)瓶，加入1 mL 完全培養(yǎng)基，定期更換培養(yǎng)基并觀察組織塊周圍細胞情況，待組織塊附近的細胞生長到70%～80%時，進行傳代培養(yǎng)或實驗干預。

1.3 免疫熒光染色方法

取生長狀況良好的VSMCs 種于6 孔板內，待細胞生長融合到70%～ 80%時，棄除培養(yǎng)基，PBS緩沖液浸洗，4%多聚甲醛固定15 min，用含0.1%Triton X-100 的PBS 緩沖液通透20 min，含1% 胎牛白蛋白+10%胎牛血清的PBS 緩沖液封閉30 min后加入一抗，4℃孵育過夜。PBS 緩沖液浸洗后，避光條件下加入熒光二抗。室溫避光孵育1 h 后滴加含DAPI 的封片劑復染細胞核，蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察，隨機選擇視野拍照并儲存，圖片后期疊加采用Image J 1.52a 版本（NIH，USA）軟件。

1.4 CCK-8 檢測方法

取生長狀態(tài)良好的VSMCs 接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。分別給予不同的藥物干預，達到干預時間后，棄除培養(yǎng)基，按照說明書加入含CCK-8 試劑的培養(yǎng)基，二氧化碳培養(yǎng)箱內孵育1 h，全波長酶標儀檢測吸光度，并分析檢測結果。

1.5 Western blot 檢測方法

取干預后的VSMCs，總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，按每孔30 μg蛋白計算上樣量，100℃變性10 min。配置十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳凝膠（SDS-PAGE），按照分組依次加樣，恒壓80 V 電泳30 min 后轉為恒壓110 V 電泳90 min。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉印到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，按目的蛋白分子量裁膜，與對應的一抗4℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜，與二抗4℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL 發(fā)光液成像，ImageJ 1.52a（NIH，USA）測量灰度值，并統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究所有實驗數(shù)據的統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software，CA）軟件。單因素多組間實驗數(shù)據的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩因素多組間實驗數(shù)據的比較采用兩因素析因設計資料的方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)的供體來源血管平滑肌細胞

主動脈中膜的主要細胞成分是VSMCs，通過組織貼壁培養(yǎng)法，VSMCs 能從主動脈中膜組織中遷移出來，并通過有絲分裂大量增殖。

圖1 原代培養(yǎng)的VSMCs光學顯微鏡下圖片（標尺=100 μm）

2.2 血管平滑肌細胞鑒定

免疫熒光染色檢測VSMCs 標志物用來鑒定從主動脈中膜中遷移出來的細胞是否為VSMCs 并檢測VSMCs 的純度。VSMCs 的標志物有多種，本實驗用來檢測VSMCs 的標志物為SM22、α-SMA、cal?ponin。VSMCs 標志物陽性且有DAPI 標記細胞核的細胞為VSMCs，見圖2。

圖2 VSMCs表型鑒定熒光顯微鏡下圖片（第一行綠色熒光為SM22陽性；第二行紅色熒光為α-SMA陽性；第三行紅色熒光為calponin 陽性；藍色熒光為DAPI，用來染細胞核；標尺=100 μm）

2.3 環(huán)丙沙星干預后血管平滑肌細胞生長曲線

給予VSMCs 不同濃度的CPFX，干預不同的時間后，加入CCK-8，測量光密度（optical density，OD）值，對OD 值進行兩因素析因設計資料的方差分析，選擇CPFX 干預的最佳濃度和時間。通過統(tǒng)計分析，CPFX 在160 μg/mL 的濃度條件下，干預72 h 差異最顯著（P<0.01），見圖3。

圖3 不同濃度CPFX 干預VSMCs 不同時間后CCK-8檢測結果（n≥3）

2.4 不同藥物干預血管平滑肌細胞后CCK-8檢測結果比較

CCK-8 可檢測CPFX、AngⅡ、CPFX+AngⅡ對VSMCs 增殖的影響，干預72 h 后，通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CPFX 組OD 值減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與對照組相比，CPFX+AngⅡ組OD 值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；與CPFX 組相比，CPFX+AngⅡ組OD 值減小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖4。

圖4 不同藥物干預VSMCs72 h 后CCK-8 檢測結果比較（n=8）

2.5 不同藥物干預血管平滑肌細胞后Ki-67 染色結果比較

Ki-67免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CPFX組VSMCs 的Ki-67 相對陽性率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與對照組相比，CPFX+AngⅡ組VSMCs 的Ki-67 相對陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；與CPFX組相比，CPFX+AngⅡ組VSMCs 的Ki-67 相對陽性率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。

圖5 不同藥物干預VSMCs 后Ki-67 染色結果比較（A 圖為熒光顯微鏡下圖像，紅色熒光為Ki-67 染色陽性，藍色熒光為DAPI，標尺=100 μm；B 圖為與對照組相比的Ki-67 相對陽性率，n≥33）

2.6 不同藥物干預血管平滑肌細胞后各表型轉換相關蛋白表達水平比較

Western blot結果顯示，與對照組相比，CPFX組VSMCs 收縮型標志物calponin、α-SMA、SM22 表達水平降低（P<0.01），分泌型標志物OPN 表達水平升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義；與對照組相比，CPFX+AngⅡ組calponin、α-SMA、SM22 表達水平降低（P<0.01），OPN 表達水平升高（P<0.001），差異有統(tǒng)計學意義；與CPFX 組相比，CP?FX+AngⅡ組calponin、α-SMA、SM22 表達水平降低（P<0.05），OPN表達水平升高（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義，見圖6。

圖6 不同藥物干預VSMCs 后各表型轉換相關蛋白表達水平比較（A 圖為VSMCs 表型轉換相關蛋白的Western blot 檢測結果，分別檢測了VSMCs 收縮型標志物calponin、α-SMA、SM22 和分泌型標志物OPN；B 圖為以GAPDH 為參照的VSMCs各表型轉換相關蛋白表達水平比較柱狀圖，n≥3）

3 討論

AD 是一種嚴重急性血管病，病死率高，其病因和發(fā)病機制錯綜復雜，常見的AD 病因和誘因包括原發(fā)性高血壓（高血壓）［11］、遺傳［12］、炎癥反應［13］、衰老［14］、VSMCs 改變［4］等。近年來，流行病學研究發(fā)現(xiàn)使用氟喹諾酮類藥物后2個月內主動脈瘤和AD 的發(fā)生率增加［5，15-16］。2019 年5 月3 日，美國食品藥品監(jiān)督管理局警示CPFX 慎用于主動脈瘤患者和高風險人群。雖然流行病學研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物增加AD 發(fā)病風險，但流行病學研究有一定的局限性，如研究中沒有明確氟喹諾酮類藥物的使用是唯一的危險因素，沒有明確氟喹諾酮類藥物種類、使用時間和使用劑量等，且對于氟喹諾酮類藥物增加AD 發(fā)病風險的機制不明。因此，單純通過流行病學研究不足以證實氟喹諾酮類藥物有增加AD 發(fā)病風險的作用。CPFX 是臨床常用的氟喹諾酮類藥物，本研究通過組織貼壁法分離培養(yǎng)供體組織來源的VSMCs，并通過免疫熒光染色鑒定分離得到的細胞為VSMCs。通過CCK-8檢測選擇CPFX 干預條件為160 μg/mL 干預72 h。AngⅡ是研究AD 的常用藥物，AngⅡ干預濃度根據文獻選擇100 nmol/L［17-18］。CCK-8 檢測和Ki-67 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CPFX 可抑制VSMCs 增殖，且CPFX+AngⅡ對VSMCs 增殖的抑制作用強于單用CPFX。在CPFX 增加小鼠AD 易感性的研究中同樣發(fā)現(xiàn)CPFX 可抑制VSMCs 增殖，且有劑量依賴性，本研究結果與文獻結果吻合，不同的是本研究所使用的CPFX 濃度與文獻不同，且本研究還發(fā)現(xiàn)CPFX+AngⅡ對VSMCs 增殖的抑制作用強于單用CPFX［10］。

VSMCs 是主動脈中膜的主要細胞成分，在病理性刺激下，VSMCs 出現(xiàn)去分化改變，收縮型的VSMCs 轉變?yōu)榉置谛偷腣SMCs［19］。大量研究證實VSMCs 表型轉換在AD 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［4，20-21］。本研究通過Western blot 分別檢測VSMCs 收縮型標志物α-SMA、SM22、calponin 表達水平和分泌型標志物OPN表達水平［22］。發(fā)現(xiàn)CPFX可引起VSMCs 收縮型標志物表達水平降低，分泌型標志物表達水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)CPFX 可引起VSMCs 由收縮型向分泌型轉換，且CPFX+AngⅡ引起VSMCs 表型轉換的作用強于單用CPFX。本研究結果提示VSMCs 表型轉換可能是CPFX 增加AD 發(fā)病風險的一種原因。

本研究雖明確了CPFX 可引起VSMCs 表型轉換，且可能是CPFX增加AD發(fā)病風險的原因，但是，在AD的眾多病因和誘因中，高血壓是最主要的致病因素，在AD患者中，超過50%以上有高血壓［23］。AD雖然是CPFX的嚴重藥物不良反應，但發(fā)生率較低，并不是AD的主要致病因素，且在臨床使用過程中，CPFX 的血藥濃度遠低于本研究中使用的濃度［24］。因此，雖然CPFX 可增加AD 發(fā)病風險，但并不影響CPFX的臨床使用，只需注意CPFX慎用于動脈瘤和高風險人群。本研究也有一定的局限性，對于CPFX引起VSMCs表型轉換的機制仍需進一步研究。