羅文娜 李 威 郭衛(wèi)春

人體骨組織具有再生潛能，對于損傷程度較輕且少量的骨缺損，人體骨組織能夠完成自我修復(fù)，但對于大塊骨缺損，骨組織則難以完成自我修復(fù)[1]。臨床上治療大塊骨缺損主要采用骨移植法。目前，骨移植材料主要包括自體骨、異體骨和人工合成骨[2]。自體骨是治療大塊骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體骨來源有限，供骨區(qū)易發(fā)生感染、出血和疼痛等并發(fā)癥，從而限制其在臨床上的使用。盡管異體骨來源相對廣泛，但異體骨移植存在疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)[3,4]。為了克服這些局限性，人們開發(fā)了各種各樣的人工合成骨用以治療大塊骨缺損[5]。

磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)與人體骨組織的無機(jī)物具有相似的化學(xué)成分，因而受到研究者的青睞[6]。盡管CPC具有良好的生物相容性，但它也存在一定的局限性，如固化時間過長、抗壓強(qiáng)度較弱以及降解速度過慢[7]。磷酸鎂骨水泥(magnesium phosphate cement, MPC)具有相對較高的力學(xué)性能和可控的降解速率等優(yōu)勢因而備受關(guān)注[8,9]。與CPC比較，MPC具有凝結(jié)快、早期強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn)，但MPC固化時間過快難以應(yīng)用于臨床[10]。

既往有研究者通過在反應(yīng)體系中加入無機(jī)物或有機(jī)物對MPC進(jìn)行改性以達(dá)到延長固化時間的效果，使其滿足臨床操作需求[4,11]。海藻酸鈉(sodium alginate, SA)是從馬尾藻或海帶中提取出來的一種高分子有機(jī)化合物，目前對于SA改性MPC的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究希望通過在反應(yīng)體系中加入不同濃度的SA，調(diào)節(jié)MPC的固化時間至合適的范圍，同時探討SA對MPC的理化性能及生物相容性的影響。

材料與方法

1.材料與試劑：輕質(zhì)氧化鎂(MgO)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司，海藻酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，成骨細(xì)胞MC3T3-E1購自國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫，CCK-8試劑盒購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，鬼筆環(huán)肽購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.骨水泥的制備：MPC包括固相和液相，固相由重?zé)齅gO和KH2PO4組成，MgO和KH2PO4以1.5∶1.0的摩爾比例混合而成，分別在固相中添加1.0%、2.5%和5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SA粉末。重?zé)齅gO由輕質(zhì)MgO在1600℃煅燒3h獲得。重?zé)齅gO與KH2PO4在球磨儀中研磨后過200目篩處理，得到樣品粉末并干燥保存。液相由去離子水組成。將固相液以2g/ml比例混合，均勻攪拌成糊狀，隨后將骨水泥轉(zhuǎn)移至模具中制備不同大小的骨水泥樣品。使用直徑為6mm、高度為12mm的模具制備出圓柱狀樣品，用于理化性質(zhì)檢測；使用直徑為6mm、厚度為1mm的模具制備出圓盤狀樣品，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。根據(jù)海藻酸鈉含量的不同，將制備的骨水泥樣品記為SA-MPC1, SA-MPC2.5和SA-MPC5，未添加海藻酸鈉的MPC作為對照組。

3.骨水泥形貌檢測：將制備的骨水泥樣品置于37℃，100%濕度條件下養(yǎng)護(hù)2天。取出樣品放入干燥箱內(nèi)干燥，隨后將樣品放入離子濺射樣品臺上噴金30s，掃描電子顯微鏡觀察樣品形貌結(jié)構(gòu)。

4.固化時間測定：根據(jù)國標(biāo)GB/T1346-2001，采用維卡儀測定固化時間。測定時，試針垂直自由地沉入水泥漿體，觀察試針讀數(shù)。從固液相混合開始計(jì)時，到進(jìn)入漿體的試針讀數(shù)不超過1mm，該段時間即為固化時間。每組樣品測試3次。

5.抗壓強(qiáng)度測定：采用萬用材料測試儀測量骨水泥的抗壓強(qiáng)度。取出養(yǎng)護(hù)2天的樣品，將樣品兩端磨平，然后用萬用材料測試儀以1mm/min的加載速度測量骨水泥抗壓強(qiáng)度。每組樣品測試3次。

6.降解速率和pH值測定：將養(yǎng)護(hù)2天的骨水泥樣品取出并烘干，記錄其初始質(zhì)量為M0。降解液為磷酸鹽緩沖鹽水(Tris-HCl, pH7.4)將骨水泥樣品與降解液按照0.05g/ml比例置于無菌試管中，并放置于37℃恒溫水浴箱中。在固定時間點(diǎn)(第1、3、7、14、21、28天)將骨水泥樣品取出，去離子水清洗3次，60℃烘箱中干燥6h，隨后測量樣品重量并記錄為M1。同時，用pH值儀測定溶液的pH值。每組樣品測試3次。降解速率記為D=(M0-M1)/M0×100%。

7.細(xì)胞增殖檢測：采用CCK8法評估MC3T3-E1細(xì)胞增殖情況。將制備好的圓盤狀骨水泥樣品用環(huán)氧乙烷滅菌，并放置在通風(fēng)干燥處7天以去除殘留的環(huán)氧乙烷氣體。隨后，將樣品放置于96孔板內(nèi)，緩慢加入配制好的培養(yǎng)基濕潤樣品。MC3T3-E1細(xì)胞以1×104的密度接種在樣品表面上，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基。在固定時間點(diǎn)(第1、3、5天)，向每孔加入10μl CCK-8溶液并將孔板在培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2h。最后，從每孔中取出100μl培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，96孔板在酶標(biāo)儀中于450nm處測定吸光度。

8.細(xì)胞黏附檢測：MC3T3-E1細(xì)胞在樣品上培養(yǎng)5天后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗樣品，然后用4%多聚甲醛溶液固定4h，梯度乙醇脫水，真空干燥后噴金，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況。

9.細(xì)胞形態(tài)檢測：MC3T3-E1細(xì)胞在樣品上培養(yǎng)5天后，4%多聚甲醛溶液固定15min, PBS清洗細(xì)胞3次，滴加0.1%TRITON，破膜20min。隨后，滴加50μl鬼筆環(huán)肽工作液，室溫孵育2h，PBS清洗3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10min。激光共聚焦顯微鏡拍照觀察細(xì)胞形態(tài)情況。

結(jié) 果

1.骨水泥形貌結(jié)構(gòu)：通過掃描電子顯微鏡觀察到，MPC表面有較多裂紋，裂紋大且寬。隨著SA含量的增加，SA-MPC表面逐漸變得平滑，且裂紋逐漸變細(xì)變窄，微觀結(jié)構(gòu)逐漸變得致密，詳見圖1。

圖1 骨水泥掃描電鏡照片(×500)A.MPC;B.SA-MPC1;C.SA-MPC2.5;D.SA-MPC5

2.固化時間和抗壓強(qiáng)度：隨著反應(yīng)體系中SA含量的增加，骨水泥的固化時間逐漸延長。骨水泥的固化時間由6.13±0.86min延長至16.43±1.50min(圖2A)。骨水泥的抗壓強(qiáng)度隨著SA含量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。MPC的抗壓強(qiáng)度為16.26±1.04MPa， SA-MPC2.5的抗壓強(qiáng)度最高，達(dá)到28.33±1.76MPa， SA-MPC5的抗壓強(qiáng)度稍下降，為25.20±2.25MPa(圖2B)。

圖2 不同組分SA對固化時間和抗壓強(qiáng)度的影響A.固化時間；B. 抗壓強(qiáng)度。與MPC比較，*P<0.05

3.降解速率和pH值變化情況：各組骨水泥的降解速率隨著時間延長逐漸增加，且添加SA的骨水泥降解速率均高于MPC組。隨著SA含量的增加，降解速率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。各組降解速率相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3A)。各組骨水泥的pH值變化趨勢相同，隨著時間延長pH值逐漸上升，且前7天上升趨勢更快，而后逐漸趨于平穩(wěn)。此外，隨著SA含量的增加，pH值呈逐漸下降趨勢(圖3B)。

圖3 不同組分SA對降解速率和pH值的影響A.降解速率；B.pH值

4.細(xì)胞增殖：隨著時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)增長趨勢，在實(shí)驗(yàn)第3天和第5天，SA-MPC2.5和SA-MPC5兩組細(xì)胞數(shù)高于MPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 不同組分SA對細(xì)胞增殖的影響與MPC比較，*P<0.05

5.細(xì)胞黏附和形態(tài)：掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，MC3E3-E1細(xì)胞在各組骨水泥表面上均能夠黏附生長，但在添加SA后，細(xì)胞胞體變大，細(xì)胞偽足多且長，彼此物理接觸較多(圖5A)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，各組細(xì)胞核未見明顯異常，細(xì)胞鋪展良好，與MPC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。

圖5 不同組分SA對細(xì)胞黏附和細(xì)胞形態(tài)的影響A.細(xì)胞黏附(×1000)；B.細(xì)胞形態(tài)(×200)

結(jié) 果

作為骨修復(fù)材料，固化時間是一個重要參考指標(biāo)[12,13]。既要給臨床醫(yī)生提供足夠的操作時間，又要在合適的時間內(nèi)固化[14]。目前，對于固化時間的范圍尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究者認(rèn)為固化時間控制在8～15min比較符合臨床操作要求[15]。磷酸鎂骨水泥的反應(yīng)機(jī)制是基于酸堿中和的快速水化反應(yīng)，其固化時間較短因而難以應(yīng)用于臨床。在本研究中，骨水泥的固化時間隨著SA的含量增加而逐漸延長，當(dāng)SA的添加量為2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時，骨水泥的固化時間延長至12min左右，介于上述范圍內(nèi)，能夠滿足臨床操作需要。在本研究中SA起到了緩凝劑的作用，可能的原因是SA作為一種有機(jī)物，在加入到反應(yīng)體系后能包裹在氧化鎂的表面，延緩鎂離子的釋放速度，進(jìn)而延緩酸堿中和反應(yīng)速度。

作為骨組織填充材料，骨水泥需要有足夠的抗壓強(qiáng)度才能應(yīng)用于人體負(fù)重骨組織中[16]。Sprio等[11]研究發(fā)現(xiàn)在摻鍶磷酸鈣骨水泥中添加海藻酸鹽可以顯著提高骨水泥的抗壓強(qiáng)度。本研究中骨水泥的抗壓強(qiáng)度隨著SA含量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中SA-MPC2.5的抗壓強(qiáng)度最高，達(dá)到28.33±1.76MPa。根據(jù)掃描電子顯微鏡結(jié)果，推測可能原因是SA能夠填充在MPC的縫隙中，減少縫隙數(shù)量，使骨水泥的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，從而引起抗壓強(qiáng)度的增加。但當(dāng)進(jìn)一步增加SA添加量時，骨水泥的抗壓強(qiáng)度卻下降，可能原因是SA的強(qiáng)度在骨水泥中占據(jù)主導(dǎo)地位，從而導(dǎo)致抗壓強(qiáng)度的下降。但對于SA如何影響抗壓強(qiáng)度的變化仍需進(jìn)一步探討。

骨修復(fù)材料應(yīng)具有生物可降解性，以便材料在降解的同時逐漸被新生骨組織替代[17]。本研究中各組骨水泥降解趨勢相似，且隨著SA含量的增加降解速率逐漸增加?？赡茉?yàn)?①與MPC比較，SA具有相對較高的溶解度，這使得SA在Tris-HCl中更易于降解;②隨著SA的降解，會在骨水泥中留下很多微小的孔洞，使水分子很容易進(jìn)入到骨水泥的內(nèi)部破壞微觀結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致降解速率增加。pH值是影響細(xì)胞活性的重要因素，過酸或過堿的環(huán)境都不利于細(xì)胞的生長。MPC中由于含有未反應(yīng)的MgO，會在溶液中形成Mg(OH)2，從而增加pH值，使溶液偏堿性。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)SA的加入降低了溶液pH值，可能原因是SA含有大量羧基，能夠釋放出H+，進(jìn)而降低pH值。因此，通過調(diào)整反應(yīng)成分，能夠獲得不同降解速率和pH值的骨水泥。

良好的生物相容性是人體植入材料的一項(xiàng)必備條件[18]。理想的骨修復(fù)材料除了具有良好的生物相容性，還應(yīng)具有刺激細(xì)胞和組織生長的生物活性。本研究采用CCK-8法評估骨水泥對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果提示各組骨水泥樣品對細(xì)胞沒有毒性，但添加SA后的骨水泥更有利于細(xì)胞增殖。此外，細(xì)胞黏附和形態(tài)結(jié)果顯示，在添加SA的骨水泥上細(xì)胞胞體變大，偽足多且長，彼此物理接觸較多，提示SA更加有利于細(xì)胞生長。以上研究結(jié)果顯示，添加SA的骨水泥沒有細(xì)胞毒性，且具有良好的生物相容性。

綜上所述，SA可有效改善MPC的理化性能，能夠調(diào)節(jié)MPC的固化時間至合適范圍并使其具有理想的抗壓強(qiáng)度，同時能夠調(diào)節(jié)降解速率和pH值使其滿足臨床需求。此外，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明SA改性的MPC具有良好的生物相容性，有潛在的臨床應(yīng)用價值。