高嘉夢 孟哲穎 李雁鳴 赫 蘭 胡 兵 申 鍔

糖尿病患者無癥狀左心室功能不全和心力衰竭發(fā)生率很高，因心力衰竭的住院率和病死率逐步增加[1]。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因[2]。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)21是一種治療代謝綜合征的藥物。在肥胖和2型糖尿病的臨床前模型中，使用FGF21治療可以改善血糖穩(wěn)態(tài)并促進體重減輕[3]。同時，在1型糖尿病模型中，F(xiàn)GF21通過顯著抑制糖尿病小鼠的心臟凋亡，預防心臟重構和心臟功能紊亂[4]。本研究利用超聲介導FGF21納泡對糖尿病小鼠進行預防性治療，觀察其對小鼠心臟結構和功能的影響。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：端羧基聚乳酸乙醇酸共聚物(濟南岱罡生物工程有限公司)，聚醚酰亞胺(上海阿拉丁公司)，聚乙烯醇(美國Sigma公司)，八氟丙烷(上海眾巍化學有限公司)，F(xiàn)GF21蛋白(北京義翹神州公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，納米粒度Zeta電位儀(美國Omni公司)，高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)，多模式小動物超聲(美國Fujifilm公司)，血糖測試儀(德國羅氏公司)。

2.FGF21納泡制備及其質量評價：采用雙乳化法制備FGF21納泡。具體過程如下：聚乳酸乙醇酸共聚物溶于二氯甲烷作為油相，加入雙蒸水作為水相，經(jīng)過聲振形成初次乳化液；向初次乳化液中加入溶解于聚乙烯醇的聚醚酰亞胺，經(jīng)過聲振形成二次乳化液。使用旋轉蒸發(fā)儀揮發(fā)有機溶劑，洗滌3次后獲得納泡；加入FGF21溶液于搖床孵育，離心洗滌獲得FGF21納泡溶液，經(jīng)冷凍干燥得FGF21納泡凍干粉，加壓注入八氟丙烷氣體和0.9%氯化鈉注射液充分振蕩即可使用。

取少量稀釋的FGF21納泡滴在載玻片上，于顯微鏡觀察；滴在硅片上，風干、噴金，于掃描電鏡觀察。同時用納米粒度Zeta電位儀分別測定載藥及空白納米其粒徑和Zeta電位。

3.動物模型建立及實驗分組：SPF級雄性C57BL/6J小鼠，6周齡，體質量18～20g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。48只小鼠適應性飼養(yǎng)達8周齡后，隨機選擇40只小鼠經(jīng)腹腔一次性注射STZ(150mg/kg)建立DM模型，其余作為對照組。DM小鼠隨機分為4組，即DM組、FGF21組、FGF21納泡組和FGF21納泡+超聲組，每組10只。72h后隨機尾靜脈取血測定血糖，血糖≥16.7mmol/L且伴有多飲、多食及多尿現(xiàn)象即建模成功。

4.治療方法：各組小鼠經(jīng)6%水合氯醛腹腔注射麻醉后，心前區(qū)備皮，對照組及DM組經(jīng)尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，F(xiàn)GF21組和FGF21納泡組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射相應劑量FGF21和FGF21納泡。FGF21納泡+超聲組小鼠經(jīng)尾靜脈注射FGF21納泡，同時在心前區(qū)放置超聲探頭進行定點靶破。其中超聲參數(shù)設置為頻率500kHz，聲壓2W/cm2，時間5min；在建模成功后開始治療，每次FGF21給藥劑量達100μg/kg，各組小鼠持續(xù)給藥8周，1周2次。

5.超聲心動圖檢查：實驗到達終點時，小鼠誘導麻醉。于胸骨旁左心室長軸M型超聲測量分析小鼠左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

6.HE染色：將取小鼠左心室壁心肌組織于固定、脫水透明、包埋、切片備用。取切片脫蠟、脫水，依次蘇木精、伊紅染色后封片，于顯微鏡下觀察心肌細胞。

7.天狼星紅染色：取石蠟切片脫蠟、脫水，天狼星紅染色封片。于顯微鏡下觀察，膠原纖維呈紅色。隨機選取3個400倍視野，計算心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)。

結 果

1.FGF21納泡的質量評價：光學顯微鏡和掃描電鏡觀察FGF21納泡呈大小均一、分布均勻的圓球形結構。納米粒度Zeta電位儀測量空白和載藥納泡的粒徑分別為877.5±23.6nm和933.2±27.4nm，粒徑的多分散性指數(shù)分別為0.106和0.168，均<0.2，表明本研究制備的空白及載藥納泡分散性好。Zeta電位結果顯示，空白和載藥納泡的Zeta電位分別為17.44±1.81mV和2.73±1.93mV，表明FGF21蛋白成功負載納泡表面，詳見圖1～圖4。

圖1 光學顯微鏡下FGF21納泡(×40)

圖2 透射電鏡下FGF21納泡(×25000)

圖3 空白納泡與FGF21納泡粒徑分布

圖4 空白納泡與FGF21納泡Zeta電位

2.超聲心動圖評價小鼠心臟功能結果：糖尿病模型建立8周后，與對照組比較，DM組小鼠LVEF、LVFS顯著降低(P<0.05)；藥物干預性治療8周后，與DM組比較，F(xiàn)GF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠LVEF、LVFS顯著升高(P<0.05)；與FGF21組比較，F(xiàn)GF21納泡+超聲組顯著升高(P<0.05)；而FGF21納泡組與DM組小鼠心臟功能指標比較，差異無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

表1 各組小鼠超聲心動圖指標測量結果

3.各組小鼠心肌組織HE染色結果：對照組小鼠心肌細胞排列規(guī)則，細胞核大小均一；與對照組比較，DM組小鼠心肌細胞明顯肥大，心肌細胞排列紊亂，細胞核增大；與DM組比較，F(xiàn)GF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠心肌細胞肥大程度降低,其中FGF21納泡+超聲組心肌細胞肥大程度降低最顯著，心肌排列較規(guī)則；而FGF21納泡組心肌細胞肥大降低程度與DM組比較，差異無統(tǒng)計學意義，詳見圖5。

圖5 各組小鼠心臟組織HE染色結果(×40)A.對照組；B.DM組；C.FGF21組；D.FGF21納泡組；E.FGF21納泡+超聲組

4.各組小鼠心肌組織天狼星染色結果：天狼星紅染色結果顯示心肌膠原纖維呈紅色。與對照組比較，DM組小鼠心肌CVF顯著升高(9.67%±1.11% vs 1.07%±0.16%，P<0.05)；與DM組比較，經(jīng)過FGF21和超聲介導FGF21納泡干預后，各組小鼠心肌CVF下降(9.67%±1.11% vs 5.04%±0.28%、3.35%±0.36%，P<0.05)；與FGF21組比較，F(xiàn)GF21納泡+超聲組心肌CVF顯著下降(P<0.05)。FGF21納泡組(8.10%±0.48%)與DM組比較，差異無統(tǒng)計學意義，詳見圖6。

圖6 各組小鼠心臟組織天狼星染色結果(×40)A.對照組；B.DM組；C.FGF21組；D.FGF21納泡組；E.FGF21納泡+超聲組

結 果

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心臟并發(fā)癥，其發(fā)生不依賴于冠狀動脈病變、高血壓或其他心臟疾病，具有高發(fā)生率和高風險特征[5]。DCM最初表現(xiàn)為舒張功能障礙，隨后發(fā)展為以各種代謝和神經(jīng)體液途徑紊亂為特征的收縮功能障礙[6]。1型糖尿病相關的DCM，其特征是心肌細胞肥大、心肌膠原沉積和左心室重構，導致左心室舒張末期容量增加，心臟收縮功能受損[7]。臨床發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的治療方法，如降糖藥、改善心功能等，不能從根本上改善臨床癥狀或治愈DCM。

FGF21在調節(jié)各種基本生理代謝過程中發(fā)揮關鍵作用，如降低血糖水平，降低肝臟和血清中甘油三酯水平[8]。越來越多的證據(jù)表明外源性FGF21對心血管疾病有保護作用。FGF21通過減輕氧化應激、減少心肌細胞炎癥、促進脂肪酸氧化、抑制心肌細胞凋亡等從而改善心肌能量供應和減輕病理性心肌重構，預防甚至逆轉糖尿病心肌病[9]。然而，外源性FGF21作為生物大分子具有一定的缺陷，如在體內(nèi)易降解、生物利用度低等，并且具有多器官效應，限制其對心臟保護作用。

微泡/納泡作為藥物遞送的載體，可以保護血液中藥物不被降解，延長循環(huán)血藥濃度、增加藥物的生物利用度。微泡/納泡遞送藥物的形式多種多樣，藥物可以通過共價鍵或非共價鍵結合在微泡表面，可以被包覆在核心，也可以通過脂質體、聚合物等結合后附著在微泡/納泡表面[10]。超聲由于可以通過細胞膜控制治療藥物的遞送，已經(jīng)成為一種具有前景的治療手段。當含氣微泡/納泡暴露在超聲波下時，發(fā)生膨脹與收縮，導致周圍的液體快速流動，對周圍組織產(chǎn)生機械作用，導致可逆性的細胞膜通透性升高，從而促進藥物釋放和通過細胞膜外滲[11]。

本研究根據(jù)前期實驗的雙乳化法，通過非共價結合方式合成載FGF21納泡[12]。已有研究證實，聚乳酸乙醇酸共聚物因具有良好的生物相容性和優(yōu)良的藥代動力學特性等優(yōu)點而成為廣泛應用的成膜材料，聚醚酰亞胺修飾的聚乳酸乙醇酸共聚物納米顆粒具有正電荷，與DNA/蛋白質靜電結合，比制備陽離子脂質體更穩(wěn)定、更易操作[13]。通過對載藥的納泡的質量考察證實，本研究制備的載FGF21納泡大小均一，分散性、穩(wěn)定性好。通過反復加壓注入八氟丙烷氣體后，實現(xiàn)體內(nèi)超聲成像和超聲靶向治療作用[14]。整個制備過程在低溫中完成，保證蛋白藥物的生物活性。在小鼠尾靜脈給藥同時，于心臟局部施加低頻超聲，實現(xiàn)載FGF21納泡在心肌組織中的定點靶向釋藥。

為了證實載FGF21納泡結合超聲靶向治療的有效性，本研究通過心臟超聲檢查，評估超聲結合FGF21納泡對糖尿病小鼠心臟的保護作用。實驗發(fā)現(xiàn)，藥物干預性治療8周后，與DM組比較，F(xiàn)GF21組、FGF21納泡+超聲組小鼠LVEF、LVFS顯著升高，與FGF21組比較，F(xiàn)GF21納泡+超聲組左心收縮功能改善更加顯著升高，而FGF21納泡組與DM組小鼠心臟功能指標比較，差異無統(tǒng)計學意義。心肌肥大、心肌纖維化是心功能減低的重要原因。同時，心肌病理組織觀察結果也證實如此，低頻超聲介導的FGF21納泡可顯著抑制糖尿病誘導的心肌組織損害和心臟重構。分析其原因可能為FGF21納泡在通過心臟血管時，在超聲波聲能下產(chǎn)生空化效應，促使FGF21蛋白的釋放，同時在機械力作用下，血管內(nèi)皮細胞間隙增寬和心肌細胞膜形成可逆性孔道，使得更多的FGF21進入心肌細胞發(fā)揮作用發(fā)揮生物效應[15]。而FGF21納泡組，由于缺乏超聲作用以及納泡的保護，釋放入血循環(huán)發(fā)揮生物效應的蛋白量更少，因此其對心臟的保護作用較弱。

綜上所述，本研究證實糖尿病小鼠心肌組織發(fā)生明顯的纖維化，心室順應性減弱，由此出現(xiàn)心功能下降現(xiàn)象。FGF21由于具有預防病理性心肌重構，F(xiàn)GF21納泡與低頻超聲的結合應用，對糖尿病誘導的心臟功能不全發(fā)揮積極預防保護作用，有望成為治療糖尿病心肌病的一種新的手段。