謝志亮，王盼，曾光輝，康華靖,3*

(1.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州 325006；2.磐安縣中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，浙江 金華 322300；3.溫州市農(nóng)林漁生態(tài)系統(tǒng)增匯減排重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江 溫州 325006)

三葉青又名三葉崖爬藤、蛇附子、石抱子、石猴子、石老鼠、金線吊葫蘆，為葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物，主要分布于浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西等10多個省區(qū)，是我國特有的名貴珍稀藥用植物[1]。三葉青以塊根或全草入藥，具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛與解熱、保肝等作用，且毒副作用小，是西藥無法代替的“植物抗生素”[2]。臨床上主要用于治療病毒性腦膜炎、乙型腦炎、病毒性肺炎、黃疸性肝炎等，特別是塊根對小兒高燒有特效[3]，是抗腫瘤常用藥物，對肺癌[4-5]、肝癌[6]、胃癌[7]、腸癌[8]、宮頸癌[9]等癌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。

三葉青生長于郁閉度較高、腐殖質(zhì)含量高、濕度大、排水透氣的山坡灌叢、山谷、溪邊林下巖石縫中[2]，以北緯27.3°以北的武夷山及福建、浙江、江西靠近武夷山的部分山區(qū)的三葉青最為正宗，而以浙江產(chǎn)三葉青為上品[10]。因其對光照、溫度、濕度等生長環(huán)境的要求嚴(yán)苛，自然條件下生長速度緩慢，產(chǎn)量極低。加之三葉青抗腫瘤作用等藥理實(shí)驗的證實(shí)，其藥效被過分的宣傳夸大，近年來人為無節(jié)制的采挖，野生三葉青已經(jīng)處于瀕臨滅絕狀態(tài)[3]。2012年三葉青被浙江省政府列入浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄，野生三葉青的采集利用受《浙江省野生植物保護(hù)辦法》(浙政令[2010]277號)制約。因此，開展三葉青野生資源人工栽培種關(guān)鍵技術(shù)研究，對珍稀三葉青資源保護(hù)和保障人民身體健康有重要意義。由于三葉青人工栽培的研究起步較晚，目前扦插繁殖雖已有報道[11-13]，但使用的插條主要是2～3 a生插條，插條用量大，所需時間較長，難以滿足規(guī)?；耘嗟男枨?。本研究采用多因素多水平的正交試驗，以生根率、平均生根數(shù)、平均最大根長、萌芽率、新梢長、根鮮重和干重為扦插生根質(zhì)量的指標(biāo)，探索三葉青單芽扦插繁殖的最佳組合方法，為三葉青野生資源保護(hù)及其產(chǎn)業(yè)化栽培提供育苗技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試三葉青為野生小葉三葉青，2016年11月采挖自溫州永嘉山區(qū)，盆栽于溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院智能溫室大棚內(nèi)。

1.2 方法

采用L16(45)正交設(shè)計研究不同基質(zhì)、激素種類及濃度組合、激素處理時間等對三葉青帶葉單芽扦插成活與生長的影響。于2017年6月4日剪取三葉青當(dāng)年生幼嫩枝條(春梢)，剪成帶葉單芽插條，插條下端長4～5 cm，上端離芽約2 cm，扦插深度為芽剛好露出基質(zhì)為宜。每處理15條插條，重復(fù)3次。扦插后及時噴霧30 min，后期根據(jù)氣候及土壤干濕情況等進(jìn)行噴霧。1個月后即7月4日調(diào)查生根率、萌芽率、新梢長。隨機(jī)選取9株，調(diào)查其1級根數(shù)量、最大根長，并洗凈根系吸干水分，用電子分析天平稱量根鮮重，80 ℃烘干12 h后再稱量根干重。驗證試驗于7月15日開始，按照上述方法進(jìn)行，處理時間同樣為1個月。

1～4水平：基質(zhì)(A)分別為草炭、1/2珍珠巖+1/2草炭、1/2珍珠巖+1/2蛭石和1/3珍珠巖+1/3草炭+1/3蛭石；時間(B)分別為5、15、30和60 s；NAA(C)分別為0、50、100和150 mg·L-1；IBA(D)分別為0、50、100和150 mg·L-1；IAA(E)分別為0、50、100和150 mg·L-1。

1.3 統(tǒng)計與分析

利用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對生根率、根數(shù)和根長的影響

插條扦插10 d左右即從剪口、節(jié)上、節(jié)間開始發(fā)根。從表1看出，除處理1外，其余15個處理的生根率均為100%，各處理間整體上無顯著差異。

表1 各處理組合對生根及植株萌芽生長的影響

不同處理間插條的平均生根數(shù)差異較大(7.2～33.7根)。比較極值可知，影響插條根數(shù)量的主次因子為B>A>C>D>E。分析K值(各水平下指標(biāo)的數(shù)值之和)可知，各因素分別以A4、B2、C3、D4、E3為最優(yōu)水平，即平均生根數(shù)量的最佳組合為A4B2C3D4E3。從最大根長來看，插條的平均最大根長在9.5～17.8 cm。比較極值可知，影響最大根長的主次因子為A>C>D>B>E。分析K值可知，因素分別以A4、B2、C2、D2、E3為最優(yōu)水平，即最大根長的最佳組合為A4B2C2D2E3。

2.2 對萌芽率和新梢長的影響

萌芽率除處理9～12較低外(以處理9最低，為6.7%)，其余12個處理的萌芽率均達(dá)100%(表1)。極值分析表明，對三葉青萌芽率影響最大的為因素A(基質(zhì))，而因素B、C、D和E影響無差異。比較K值可知，各因素分別以A1、A2、A4、B3、C2、D1、E3為最優(yōu)水平，即A1(A2、A4)B3C2D1E3為誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的最佳組合。新梢平均長度與萌芽率相似，以9～12處理的新梢長度最短(小于3 cm)。而其余12個處理的新梢長度均在11 cm以上，最長達(dá)到14.1 cm。極值分析表明，影響新梢長度的主次因子為A>E>B>D>C。比較K值可知，各因素分別以A4、B4、C3、C4、D1、E2為最優(yōu)水平，即新梢長度的最佳組合為A4B4C3(C4)D1E2。

2.3 對平均根鮮重和干重的影響

表1顯示，平均單株根鮮重以處理1(0.17 g)最小、處理15最大(0.45 g)。極值分析表明，影響平均根鮮重的主次因子為A>C>B>E>D。比較K值，各因素分別以A4、B2、C2、D4、E1、E2為最優(yōu)水平，即平均根鮮重的最佳組合為A4B2C2D4E1(E2)。平均單株根干重與平均根鮮重相似，以處理1最小，為0.023 g；最大為處理15，為0.041 g。極值分析表明，影響平均單株根干重的主次因子為A>C>E>D>B。比較K值，各因素分別以A3、B2、C2、D4、E2為最優(yōu)水平，即平均根干重的最佳組合為A3B2C2D4E2。

2.4 驗證試驗

影響三葉青嫩枝單芽帶葉插條生根數(shù)、生根長度、根鮮重、根干重、萌芽率和新梢長度的因素主要為基質(zhì)，而影響生根數(shù)量的因素主要為處理時間。綜合分析后認(rèn)為A4B2C2D4E3較為適宜三葉青嫩枝單芽帶葉扦插，即基質(zhì)為1/3珍珠巖+1/3草炭+1/3蛭石，用NAA 50 mg·L-1+IBA 150 mg·L-1+IAA 100 mg·L-1浸蘸15 s。驗證試驗結(jié)果表明，三葉青生根率和萌芽率均達(dá)到100%，其中平均根數(shù)28.5條，最大根長16.4 cm，平均梢長16.2 cm，平均根鮮重0.36 g，平均根干重0.034 g。

3 討論

三葉青資源稀缺而需求量大，藥材市場上供不應(yīng)求，偽混品眾多，嚴(yán)重影響臨床療效。吉慶勇等[14]的研究結(jié)果顯示，對于三葉青最主要的活性成分黃酮，人工種植植株和野生植株沒有顯著的差異，這表明人工種植的三葉青能夠代替野生三葉青滿足市場的藥用需求。因此，三葉青人工種植取代野生資源的依賴勢在必行，探討三葉青種苗高效無性扦插繁殖技術(shù)對野生三葉青種質(zhì)資源保護(hù)和三葉青的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

研究認(rèn)為，插穗生長年限是影響三葉青枝條扦插繁殖的重要因素[11]。周小卿等[10]認(rèn)為，半木質(zhì)化的三葉青枝條含營養(yǎng)物質(zhì)多且整條枝都具有運(yùn)輸水分的功能，在能保證足夠濕度的情況下，插穗留的葉片多，光合作用強(qiáng)，合成有機(jī)物多，從而促進(jìn)長根。胡春梅等[15]對三葉青不同插穗類型對生根質(zhì)量指數(shù)影響的研究也表明，半木質(zhì)化帶2片葉的效果最好，半木質(zhì)化帶1片葉的效果次之，嫩枝帶2片葉的效果居第三，嫩枝帶1片葉的效果最差。然而，袁蓮蓮等[12]則認(rèn)為三葉青扦插繁殖以當(dāng)年生嫩枝為佳。本試驗用嫩枝單芽的扦插試驗結(jié)果也表明，生根率為100%，萌發(fā)率整體也較高，根和新梢生長良好。另外，通過觀察，本試驗中扦插后10 d開始生根，時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于同類相關(guān)研究[15]。由此可見，嫩枝單芽扦插不僅能節(jié)約用枝，還能快速大量繁育幼苗。

本試驗的扦插基質(zhì)種類對插條平均生根數(shù)、平均生根長度、平均根鮮重、平均根干重、平均萌芽率和新梢平均長度均有顯著影響。已有相關(guān)研究表明，新鮮黃泥基質(zhì)對三葉青扦插效果最好，其生根數(shù)量最多，生根率最高，生根長度最長[11,15]。分析認(rèn)為，這是由于新鮮黃泥質(zhì)地疏松，具有較好的吸水保水性能，清潔干凈、污染少，含有胡敏酸為微酸性土壤，能促進(jìn)植株發(fā)新根[16]。本試驗的結(jié)果也表明透氣有保水的基質(zhì)配方——1/3珍珠巖+1/3草炭+1/3蛭石的扦插基質(zhì)效果最佳。

植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度及浸泡時間對三葉青根的生長發(fā)育均有顯著影響。胡春梅等[15]研究認(rèn)為，IBA對生根率、平均根數(shù)、平均根長、生根質(zhì)量等各項指標(biāo)都表現(xiàn)最好，NAA的效果次之，究其原因，生長素類的NAA和IBA含有硫脲基團(tuán)，能使細(xì)胞壁松馳，促進(jìn)合成蛋白質(zhì)等物質(zhì)，能促進(jìn)植物根細(xì)胞的生長。華金渭等[13]研究也表明，用6-BA和IAA的混合液能促進(jìn)三葉青1 a生枝插條的生根。本試驗結(jié)果表明，NAA對三葉青扦插生根的平均根數(shù)、最大根長及根的干鮮重影響較大。從植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度處理對三葉青生根情況的影響效果來看，植物生長調(diào)節(jié)劑處理的濃度為100 mg·L-1時，三葉青扦插繁殖生根效果最好，生根率最高，平均根數(shù)最多，平均根長最長。玉屏等[17]研究表明，激素濃度為1 000 mg·L-1時，扦插于黃壤、黑壤中效果均較好。同樣，吉慶勇等[11]認(rèn)為，用2～3 a生的老枝在1 000 mg·L-1IBA中浸漬10 s后扦插于黃土中生根效果最佳。本文NAA處理最佳濃度為50 mg·L-1。這與上述研究差異較大，濃度相差較大的原因有可能與選擇的枝條年齡有關(guān)。

4 小結(jié)

采用正交試驗設(shè)計，研究基質(zhì)、外源激素種類與濃度組合及浸蘸時間對當(dāng)年生帶葉單芽嫩枝(春梢)扦插成活的影響表明，扦插基質(zhì)類型是影響單芽插條萌芽率、新梢長度、最大根長、根鮮重和根干重的主要因素，而影響嫩枝帶葉單芽插條生根數(shù)量的主要因素是激素處理時間。綜合試驗結(jié)果認(rèn)為，當(dāng)年生帶葉單芽嫩枝插條用NAA 50 mg·L-1+IBA 150 mg·L-1+IAA 100 mg·L-1浸蘸15 s后，扦插于1/3珍珠巖+1/3草炭+1/3蛭石的基質(zhì)上效果最佳。驗證試驗也表明，上述組合處理1個月后的生根率和萌芽率均達(dá)100%，平均最大根長16.4 cm，平均每株生根28.5條，根鮮重0.36 g，根干重0.034 g，新梢長度16.2 cm，部分插條葉腋處有2個新梢萌發(fā)。