張改清 陰彩霞

(1呂梁學(xué)院化學(xué)化工系，呂梁 033000)

(2山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006)

硫醇主要包括脂肪硫醇和苯硫醇。半胱氨酸(cysteine，Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等脂肪硫醇在生理過程中起著非常重要的作用[1-7]。作為硫醇的一種，苯硫酚被廣泛用于農(nóng)藥生產(chǎn)、化學(xué)合成、制藥工程和工業(yè)生產(chǎn)中的重要中間體，其使用不可避免地面臨高毒性和高污染的重要問題[8-9]。苯硫酚及其衍生物具有高毒性，苯硫酚對(duì)魚類的半致死劑量(LC50)范圍為0.01～0.4 mmol·L-1[10]，對(duì)小鼠的LC50 為2.15～46.2 mg·kg-1[11]。生物體長(zhǎng)期接觸硫酚會(huì)嚴(yán)重?fù)p害中樞神經(jīng)和其他神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致呼吸急促、肌肉無力、后肢麻痹、昏迷甚至死亡[12-13]。因此，考慮到苯硫酚對(duì)生物和環(huán)境的不良影響，開發(fā)檢測(cè)苯硫酚的簡(jiǎn)單、靈敏和具有選擇性的方法是非常重要的。

由于具有成本低、靈敏度高以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，熒光方法已在檢測(cè)和標(biāo)記中得到廣泛應(yīng)用，是一種非常有前景的工具[14]。由于異佛爾酮衍生物類熒光染料具有給體-π-受體(D-π-A)結(jié)構(gòu)，其超快的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移電荷(ICT)引起大的斯托克斯位移[15]，該類染料已經(jīng)開始應(yīng)用于各類熒光探針的設(shè)計(jì)[16-17]。

到目前為止，許多苯硫酚熒光探針已經(jīng)被設(shè)計(jì)、合成出來[18-20]，但是大多數(shù)熒光探針仍是短波長(zhǎng)發(fā)射。我們用2，4-硝基苯氟苯修飾了二氰基異佛爾酮衍生物，用作熒光開關(guān)，以獲得用于檢測(cè)苯硫酚的探針YC1。由于2，4-二硝基苯強(qiáng)的吸電子能力導(dǎo)致的部分的光致電子轉(zhuǎn)移(PET)過程，探針YC1基本上具有較弱的熒光。苯硫酚通過芳香族親核取代反應(yīng)機(jī)理與探針YC1 發(fā)生反應(yīng)，2，4-二硝基苯作為離去基團(tuán)離去，隨后釋放熒光化合物2(發(fā)射峰主要在594 nm處)，熒光響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)(turn-on)，計(jì)算得到相應(yīng)的檢出限為0.65 μmol·L-1。此外，探針被成功應(yīng)用于HeLa細(xì)胞內(nèi)4-甲基苯硫酚的成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀 器

所用儀器有ME204E 電子天平、FE20-FIve Easy PlusTM酸度計(jì)、Bruker AVANCE-600 MHz 核磁共振儀、LTQ-MS(Thermo)電噴霧質(zhì)譜、U-3900 紫外-可見分光光度計(jì)、F-7000 熒光分光光度計(jì)、TCS SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.1.2 試 劑

異佛爾酮、丙二腈、哌啶、冰醋酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(香草醛)、2，4-二硝基氟苯和4-甲基苯硫酚等均為分析純，購自上海阿拉丁試劑有限公司。4-甲基苯硫酚以及探針YC1 的儲(chǔ)備溶液用二甲亞砜(DMSO)溶液作為溶劑配制得到。

1.2 探針YC1的制備

探針YC1 的合成路線及響應(yīng)機(jī)理如Scheme 1所示，探針YC1通過3步反應(yīng)即可得到。

化合物1 和化合物2 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法合成[21]。

探針YC1 的合成：向化合物2(640 mg，2.0 mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(DMF，10 mL)的混合溶液中加入1-氟-2，4-二硝基苯(391 mg，2.1 mmol)和K2CO3(548 mg，4 mmol)，室溫?cái)嚢? h。反應(yīng)過程通過TLC 監(jiān)測(cè)。待反應(yīng)完成后，除去溶劑。所得粗產(chǎn)品通過硅膠柱色譜法(乙酸乙酯/石油醚，1∶3，V/V)純化，得到深黃色固體YC1(613 mg，產(chǎn)率為63%)。

結(jié)構(gòu)表征：1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ8.90(d，J=13.2 Hz，1H)，8.41(d，J=9.2 Hz，1H)，7.67(d，J=21.9 Hz，1H)，7.59～7.47(m，1H)，7.45～7.30(m，3H)，7.03(d，J=9.3 Hz，1H)，6.93(s，1H)，3.83(d，J=19.3 Hz，3H)，2.63(d，J=18.8 Hz，2H)，2.57(s，2H)，1.04(s，6H)。13C NMR(151 MHz，DMSO-d6)：δ170.8，156.1，155.4，151.4，142.2，141.6，138.8，137.0，136.4，130.8,130.0,123.6，123.1，122.5，122.3，118.1，114.3，113.5,112.6,77.2,56.6，42.8，38.7，32.2，27.9。ESI-MSm/z：[YC1-H]-即[C26H22N4O6-H]-計(jì)算值485.146 1；實(shí)測(cè)值485.147 0。元素分析按C26H22N4O6的計(jì)算值(%)：C 64.19，H 4.56，N 11.52。實(shí)測(cè)值(%)：C 64.15，H 4.57，N 11.54。

Scheme 1 Synthetic route of probe YC1

1.3 細(xì)胞成像

將HeLa細(xì)胞接種在激光共聚焦培養(yǎng)皿中，并將細(xì)胞于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h以進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)。熒光成像通過共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行。在種有HeLa 細(xì)胞的激光共聚焦培養(yǎng)皿中用探針YC1(5 μmol·L-1)預(yù)處理20 min。外源性4-甲基苯硫酚成像：再孵入20 μmol·L-14-甲基苯硫酚孵育30 min，用458 nm 激發(fā)獲得在紅色通道中的活細(xì)胞激光共聚焦成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針YC1的設(shè)計(jì)以及響應(yīng)機(jī)制

考慮到二氰基異佛爾酮作為熒光母體是一種典型的基于ICT 的熒光團(tuán)，具有長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光發(fā)射、大的斯托克斯位移和良好的光穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，我們選擇二氰基異佛爾酮作為設(shè)計(jì)探針的熒光團(tuán)，通過一個(gè)醚鍵，將二氰基異佛爾酮熒光母體與2，4-二硝基苯基作為識(shí)別位點(diǎn)的兩部分連接成一體。由于2,4-二硝基苯強(qiáng)的吸電子能力導(dǎo)致的部分的PET 過程，探針YC1 基本上是較弱的熒光。苯硫酚中的羥基具有強(qiáng)的親核性，通過芳香族親核取代反應(yīng)機(jī)理與探針YC1 發(fā)生反應(yīng)，2，4-二硝基苯作為離去基團(tuán)離去，隨后釋放熒光化合物2(主要是酚形式，發(fā)射峰主要在594 nm 處)，熒光響應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)(turn-on)。Scheme 2 顯示了YC1 探針對(duì)4-甲基苯硫酚的檢測(cè)機(jī)理。通過質(zhì)譜法驗(yàn)證了該機(jī)理。在圖S4(Supporting information)的核磁氫譜中，我們找到了反應(yīng)后熒光母體上活潑氫的化學(xué)位移δ=9.60。核磁結(jié)果支持了Scheme 2 中的反應(yīng)機(jī)理。此外，由質(zhì)譜(圖S5)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，[YC1+4-methylthiophenol-H]-(即[C26H22N4O6+C7H8S-H]-)的m/z計(jì)算值319.145 2，與實(shí)測(cè)值(319.1450 7)吻合，這也支持了Scheme 2 中的反應(yīng)機(jī)理。

Scheme 2 Response mechanism of probe YC1 for detecting 4-methylthiophenol

2.2 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光譜研究

圖1 探針YC1檢測(cè)4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

探針YC1 檢測(cè)4-甲基苯硫酚的UV-Vis 吸收光譜如圖1 所示。當(dāng)200 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚加入到含有10 μmol·L-1探針YC1 的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，隨著時(shí)間的增加，405 nm 處的吸收峰值逐漸下降且紅移至442 nm 處，同時(shí)在598 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰且峰值逐漸升高，同時(shí)，溶液顏色由淺黃色變?yōu)樯铧S色。二氰基異佛爾酮類熒光團(tuán)的pKa較高(7.90)，在生理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生部分解離，從而生成2種熒光團(tuán)：酚形式(主要形式)和酚鹽形式(次要形式)。405 nm 為探針自身的吸收峰。當(dāng)與苯硫酚反應(yīng)后，生成帶有羥基的二氰基異佛爾酮類熒光團(tuán)，部分解離生成2 種形式的熒光團(tuán)的酚形式(主要形式)和酚鹽形式(次要形式)，UV-Vis 光譜中442 nm 為酚形式的吸收，598 nm為酚鹽形式的吸收。這說明探針YC1 與4-甲基苯硫酚反應(yīng)生成了新的化合物，與前述核磁與質(zhì)譜的結(jié)果一致。

2.3 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的熒光光譜研究

探針YC1檢測(cè)4-甲基苯硫酚的熒光光譜如圖2所示。探針YC1 在該體系中有較弱的熒光。當(dāng)30 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚加入到含有5 μmol·L-1探針YC1的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，隨著時(shí)間的增加，594 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這說明探針YC1 能夠用來識(shí)別4-甲基苯硫酚，且具有明顯的熒光增強(qiáng)(turn-on)響應(yīng)。

2.4 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的動(dòng)力學(xué)研究

圖2 探針YC1檢測(cè)4-甲基苯硫酚的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

探針YC1 檢測(cè)4-甲基苯硫酚的動(dòng)力學(xué)研究使用的是熒光光譜法，結(jié)果如圖3 所示。對(duì)探針YC1持續(xù)光照1.5 h 之后，熒光強(qiáng)度基本不變，說明探針YC1 具有一定的光穩(wěn)定性。當(dāng)不同濃度的4-甲基苯硫酚(0、5、10、15、20、25 和30 μmol·L-1)加入到含有5 μmol·L-1探針YC1 的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，可以發(fā)現(xiàn)4-甲基苯硫酚的濃度為20 μmol·L-1，時(shí)間約90 min 時(shí)，熒光響應(yīng)信號(hào)基本達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)(激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為594 nm，激發(fā)狹縫寬度/發(fā)射狹縫寬度：5 nm/5 nm)。

圖3 探針YC1檢測(cè)4-甲基苯硫酚的動(dòng)力學(xué)Fig.3 Kinetic of detecting 4-methylthiophenol by YC1 probe

2.5 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的pH體系研究

為了考察探針YC1 識(shí)別4-甲基苯硫酚的有效pH 范圍，我們研究了不同pH 值(2～10)對(duì)探針YC1(5 μmol·L-1)和YC1(5 μmol·L-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)熒光性質(zhì)的影響。從圖4 中，我們可以發(fā)現(xiàn)強(qiáng)酸以及強(qiáng)堿條件對(duì)探針YC1 本身的熒光強(qiáng)度沒有影響。而探針YC1 檢測(cè)4-甲基苯硫酚時(shí)，在pH=6.0～8.0范圍內(nèi)熒光響應(yīng)信號(hào)明顯。這一結(jié)果表明，該探針能夠應(yīng)用于生理環(huán)境下檢測(cè)苯硫酚。

圖4 不同pH值下YC1(5 μmol·L-1)和YC1(5 μmol·L-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)的熒光強(qiáng)度Fig.4 Fluorescence intensity of YC1(5 μmol·L-1)and YC1(5 μmol·L-1)+4-methylthiophenol(20 μmol·L-1)under different pH values

2.6 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的選擇性研究

為了研究探針YC1 的選擇性，采用熒光光譜考察了探針YC1 對(duì)4-甲基苯硫酚的識(shí)別性能。在含有5 μmol·L-1探針YC1 的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)體系中，先后分別加入100 μmol·L-1各種分析物與20 μmol·L-14-甲基苯硫酚，分別進(jìn)行檢測(cè)。各種分析物分為2 組，第1 組如圖5a 所示，第2 組如圖5b所示?？梢钥闯?，探針與其他分析物不能引起YC1在594 nm 處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而只有在4-甲基苯硫酚(20 μmol·L-1)存在的情況下，YC1 在594 nm 處的熒光強(qiáng)度才能增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，探針YC1 可以較好地選擇性識(shí)別4-甲基苯硫酚，其他分析物的存在不干擾探針YC1對(duì)4-甲基苯硫酚的檢測(cè)。

2.7 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的檢測(cè)限研究

為了研究探針YC1 對(duì)4-甲基苯硫酚的靈敏度，我們將不同濃度的4-甲基苯硫酚(2～10 μmol·L-1)分別加入到含有5 μmol·L-1探針YC1 的3 種不同混合體系中，測(cè)試其相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。根據(jù)594 nm 處的熒光強(qiáng)度變化值與對(duì)應(yīng)的4-甲基苯硫酚濃度得到工作曲線(Y=Ac+B)，c的單位為μmol·L-1，測(cè)量時(shí)的激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm，結(jié)果如圖6 所示。根據(jù)IUPAC規(guī)定的檢測(cè)限公式：LOD=kSb/m[22](其中k為與置信度有關(guān)的常數(shù)，IUPAC建議取k=3，Sb為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，m為分析標(biāo)準(zhǔn)曲線在低濃度范圍內(nèi)的斜率)，可以算出探針YC1 在池塘水、自來水和PBS 中對(duì)4-甲基苯硫酚的檢測(cè)限分別為0.19、0.38和0.65 μmol·L-1，。

圖5 探針YC1對(duì)4-甲基苯硫酚的選擇性及分析物競(jìng)爭(zhēng)性Fig.5 Selectivity and analyte competitive of YC1 probe to 4-methylthiophenol

圖6 在不同水樣中探針YC1熒光強(qiáng)度與4-甲基苯硫酚濃度的線性相關(guān):(a)池塘水、(b)自來水和(c)PBSFig.6 Linear correlation between fluorescence intensity of probe YC1 and 4-methylthiophenol concentration in different water samples:(a)pond water,(b)tap water and(c)PBS

2.8 探針YC1識(shí)別4-甲基苯硫酚的細(xì)胞成像研究

探針YC1 在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)4-甲基苯硫酚的成像標(biāo)記能力通過激光共聚焦顯微鏡來評(píng)估。圖7所示的是將5 μmol·L-1探針孵育到HeLa 細(xì)胞中，20 min后沒有明顯的熒光信號(hào)；接著將5 μmol·L-1探針孵育到HeLa 細(xì)胞中，再孵入20 μmol·L-1的4-甲基苯硫酚，30 min 后產(chǎn)生明顯的紅色熒光。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明探針具有較好的細(xì)胞膜通透性，并且探針可以用來標(biāo)記活細(xì)胞中外源性的4-甲基苯硫酚。

圖7 探針YC1對(duì)4-甲基苯硫酚的激光共聚焦成像:只有探針的熒光圖(a1)和明場(chǎng)圖(a2);外源性4-甲基苯硫酚響應(yīng)熒光圖(b1)和明場(chǎng)圖(b2)Fig.7 Confocal laser imaging of probe YC1:fluorescence image(a1)and bright field image(a2)of the probe;fluorescence image(b1)and bright field image(b2)of exogenous 4-methylthiophenol response

3 結(jié) 論

我們選擇具有強(qiáng)吸電子基的2，4-二硝基苯與二氰基異佛爾酮衍生物連接，設(shè)計(jì)并合成了基于二氰基異佛爾酮的熒光探針YC1 用于特異性檢測(cè)苯硫酚。苯硫酚通過芳香族親核取代機(jī)制與探針YC1 發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致2，4-二硝基苯部分離去，隨后釋放具有明顯熒光發(fā)射的化合物2，熒光響應(yīng)信號(hào)(594 nm)增強(qiáng)。在PBS/DMSO 的體系中，YC1對(duì)苯硫酚的檢出限為0.65 μmol·L-1。該方法是基于探針YC1 對(duì)4-甲基苯硫酚的識(shí)別具有熒光增強(qiáng)(turn-on)的性質(zhì)。此外，探針還可以在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)外源性4-甲基苯硫酚的熒光成像。該檢測(cè)方法可以為今后的苯硫酚檢測(cè)提供一個(gè)有用的工具與手段。

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