林福星 戴婧婷 羅菊香 張建漢

【摘 要】 殼聚糖毒性很低、生物相容性很好，同時(shí)又能夠在生物體內(nèi)降解，而受到學(xué)者們的關(guān)注。然而殼聚糖的水溶性太差，使得應(yīng)用研究很難開(kāi)展。本文研究證實(shí)，裂解后HBC的分子量明顯降低，而MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，裂解后HBC的細(xì)胞毒性依然很低，完全可以應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。本課題為溫敏型生物材料HBC在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 生物材料;殼聚糖;輻射裂解;分子量;細(xì)胞毒性

【中圖分類(lèi)號(hào)】 Q356.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 2096-4102（2021）03-0097-03

殼聚糖是脫乙酰度（脫去乙酰基的葡萄糖胺單元數(shù)占總單元數(shù)的比例）在55%以上的甲殼質(zhì)的總稱(chēng)。殼聚糖具備了低細(xì)胞毒性、優(yōu)異的生物相容性、自然生物可降解性等優(yōu)良性能，在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用中具備極大的潛力。

在分子結(jié)構(gòu)上，由于殼聚糖鏈上眾多的羥基（-OH）以及氨基（-NH2）等基團(tuán)很容易形成氫鍵，因此，殼聚糖的溶解性非常差。容易發(fā)生聚沉，穩(wěn)定的溶液濃度較低。通常，殼聚糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)只能是1%-3%。

殼聚糖的應(yīng)用在食品、化妝品等行業(yè)很常見(jiàn)，然而，殼聚糖的應(yīng)用性能始終受限于溶解性，存在明顯的瓶頸。為了解決這個(gè)難題，本課題組設(shè)計(jì)改性并報(bào)道合成了一種親水性殼聚糖——羥丁基殼聚糖（HBC）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，HBC在溶解性上有了比較大的提升。

由于生物材料在應(yīng)用過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)用到輻射滅菌技術(shù)，以保證生物材料的安全性能。因此，對(duì)于生物材料HBC而言，他們的抗輻射穩(wěn)定性需要進(jìn)行一定的探索，并且研究他們?cè)谳椪者^(guò)程中的變化。

本研究通過(guò)之前報(bào)道的方法將羥丁基鍵合到殼聚糖的羥基和氨基上，成功合成了HBC。為了驗(yàn)證HBC的輻射穩(wěn)定性以及輻射產(chǎn)物的安全性，將HBC溶液放置在60Coγ-ray的輻照下進(jìn)行一定劑量（分別是0kGy，1kGy，2kGy，3kGy，5kGy，10kGy，）的輻照。之后對(duì)輻照制備的樣品進(jìn)行后續(xù)的分析，包括分子量的測(cè)定和細(xì)胞毒性的研究。研究結(jié)果證實(shí)，經(jīng)過(guò)輻照裂解過(guò)程之后，HBC分子量有所降低，且降低的程度與輻照劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。另外，細(xì)胞毒性MTT實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過(guò)輻照裂解后的HBC毒性非常低，哪怕在10ug/mL的濃度下，細(xì)胞存活率依然在93.3%。這充分說(shuō)明了HBC對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有毒性作用，是非常良好的生物材料。這為HBC在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

殼聚糖（分子量Mw=2.0×105Da，脫乙酰度≧90%）以及1，2-環(huán)氧丁烷購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。聚乙酰亞胺（PEI）來(lái)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。氫氧化鈉（片狀，97.0%-100%）、異丙醇（99.7%）、丙酮（99.5%）購(gòu)自醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)使用的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基氮唑溴鹽（MTT）由碧云天生物科技有限公司提供，人宮頸癌細(xì)胞（Hela）培養(yǎng)在37oC以及含5%CO2的空氣中。胎牛血清從浙江天杭生物科技股份有限公司購(gòu)買(mǎi)，青霉素-鏈霉素從美國(guó)英杰生物試劑有限公司購(gòu)買(mǎi)，并添加在DMEM全培養(yǎng)基中。

本實(shí)驗(yàn)中所使用的水均為去離子水，且上述試劑均為即買(mǎi)即用。

1.2 HBC的制備過(guò)程

HBC的制備原理如圖1所示。

首先，稱(chēng)取25gNaOH片狀固體加入100mL燒杯，倒入50mL水并快速攪拌，待片狀固體全部溶解后通氮?dú)?5min。隨后，取4g殼聚糖粉末加入上述的NaOH溶液中繼續(xù)攪拌，通氮?dú)?5min。過(guò)濾，并用水洗至pH=7。之后，將濾紙上的固體加入到異丙醇/水混合溶液（V∶V=9∶1）中，并攪拌反應(yīng)24h。接著，將1，2-環(huán)氧丁烷加入上一步的溶液，并繼續(xù)通氮?dú)?5min，攪拌反應(yīng)4d。然后，用丙酮沉淀并離心。將離心下來(lái)的沉淀物用水超聲洗滌，再離心分離，直至pH=9，真空干燥24h。

1.3不同吸收劑量的輻照后羥丁基殼聚糖的制備（HBC-X，X表示輻照過(guò)程中的總吸收劑量）

為了研究羥丁基殼聚糖在輻照過(guò)程的性能變化，需要將HBC溶液置于輻射源的輻照下。首先，用天平稱(chēng)取10mg的羥丁基殼聚糖粉末溶解在上述的10mL濃度為0.1mol/L乙酸溶液中，超聲溶解，并通氮?dú)?0min。之后，將羥丁基殼聚糖溶液樣品置于60Coγ-ray下輻照，劑量率為8.3Gy/min?？刂撇煌奈談┝?，得到不同的輻照后羥丁基殼聚糖（HBC-X）。

1.4 HBC-X的分子量測(cè)定

為了探究HBC溶液在輻照過(guò)程中變化，通過(guò)黏度法在25±0.1℃對(duì)不同吸收劑量輻照后的HBC樣品分子量進(jìn)行測(cè)定。純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間以1%的醋酸溶液在烏氏黏度計(jì)內(nèi)的流出時(shí)間t0計(jì)算。在測(cè)試過(guò)程中，每個(gè)流出時(shí)間的測(cè)定都需要進(jìn)行3次取平均值，且3次測(cè)量結(jié)果之間的極差不超過(guò)0.5s。接著，測(cè)定吸收不同劑量輻照的HBC樣品（HBC-0、HBC-1、HBC-2和HBC-3、HBC-5、HBC-10）的設(shè)置濃度梯度溶液（1、2/3、1/2）的流出時(shí)間，分別記為t1、t2和t3，然后根據(jù)設(shè)置濃度梯度的羥丁基殼聚糖溶液的流出時(shí)間（t1、t2和t3）和純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間（t0），分別計(jì)算不同吸收劑量輻照后的HBC溶液的增比黏度?sp和相對(duì)黏度?r。最后，通過(guò)?sp/c和ln?r/c分別對(duì)HBC溶液的濃度c作圖，外推可得不同HBC溶液的特性黏度[?]，并通過(guò)公式1計(jì)算不同吸收劑量輻照后HBC的分子量。

[?]=K·Mα 公式1

公式1中，[?]是測(cè)得的特性黏度，K=1.8×10-3cm3·g-1，α=0.93，均為常數(shù)。

1.5 HBC-X的細(xì)胞毒性研究

為了體現(xiàn)HBC-X的細(xì)胞毒性水平，本次實(shí)驗(yàn)選用常用的生物材料PEI作為對(duì)照，通過(guò)MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)表征測(cè)定。首先，以每孔5000個(gè)的密度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行Hela細(xì)胞的培養(yǎng)，每孔添加200?L的含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基，37oC下生長(zhǎng)15h。之后讓細(xì)胞在100?L分別包含了HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3和PEI材料的全培養(yǎng)基中，保持溫度37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)48h。同時(shí)，一組添加100?L不含其他材料的細(xì)胞在純培養(yǎng)基中的自然生長(zhǎng)設(shè)置作為空白對(duì)照。Hela細(xì)胞培養(yǎng)48h之后，將所有孔的培養(yǎng)液替換為20?LMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)4h的孵化。結(jié)束后，每個(gè)孔中加入150?L的DMSO。最后，通過(guò)酶標(biāo)儀（美國(guó)博騰儀器有限公司）測(cè)定各個(gè)孔中細(xì)胞在490nm波長(zhǎng)的吸光度。各種材料不同濃度的細(xì)胞毒性都可以通過(guò)細(xì)胞存活率來(lái)體現(xiàn)，細(xì)胞的存活率（Cellviability）通過(guò)公式2來(lái)計(jì)算。

[Cell viability%=AsampleAcontrol×100%] 公式2

公式2中，Asample和Acontrol分別代表材料測(cè)試組與所設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞在490nm波長(zhǎng)的吸光度值。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HBC-X的制備

從圖1中可以很清楚地看到，沒(méi)有接受輻照的HBC溶液，是澄清無(wú)色的。經(jīng)過(guò)1kGy的吸收劑量的輻照，HBC樣品溶液的顏色變成了圖中中間的淺黃色。而隨著吸收劑量的增大，殼聚糖溶液的顏色越來(lái)越少，當(dāng)HBC溶液樣品被γ-ray輻照時(shí)，葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺單元的β（1-4）糖苷鍵斷裂，使得HBC的主鏈發(fā)生了鏈斷裂。另外，輻照過(guò)程通常伴隨著一些氧化反應(yīng)，產(chǎn)生含大量的羰基和羧基，導(dǎo)致了整個(gè)溶液的顏色變黃。

2.2 HBC-X的分子量

烏氏黏度計(jì)法測(cè)得輻照后HBC溶液樣品的分子量如圖2所示。

不同吸收劑量輻照過(guò)后的HBC樣品測(cè)得的分子量，相比于原來(lái)的HBC-0，都有所降低。從圖2上最左邊，輻照之前的HBC-0組，分子量為35.0×104g·mol-1。吸收劑量為1kGy時(shí)，HBC樣品的分子量已經(jīng)降為HBC-1的30.16×104g·mol-1。要是劑量加大到3kGy，分子量就只剩下26.34×104g·mol-1。而HBC-10這組材料，吸收劑量10kGy的時(shí)候，殼聚糖降解更加的明顯，分子量?jī)H為19.27×104g·mol-1。HBC樣品輻照后的分子量降低，說(shuō)明輻照過(guò)程中被一定程度降解。并且可以看到這樣的規(guī)律，隨著吸收劑量的增加，降解的程度越高，分子量降低越發(fā)明顯。

2.3 HBC-X與PEI的細(xì)胞毒性探究

對(duì)于吸收不同計(jì)量的輻照之后的產(chǎn)物（HBC-0、HBC-1、HBC-2、HBC-3）和PEI在不同濃度下的細(xì)胞毒性通過(guò)MTT法進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。

HBC-0組，也就是未經(jīng)過(guò)輻照的羥丁基殼聚糖，細(xì)胞存活率都接近100%，即使?jié)舛仍龃蠛芏啾?，?xì)胞存活率也沒(méi)有明顯的降低。對(duì)于吸收一定劑量輻照之后的HBC，在0.5μg/mL的濃度下，HBC-1、HBC-2和HBC-3的細(xì)胞存活率分別是99.5%，97.3%和93.3%，遠(yuǎn)高于PEI組的60.8%。當(dāng)HBC樣品濃度從0.5μg/mL增大到10μg/mL，細(xì)胞存活率雖然有所降低，但是依然呈現(xiàn)比較健康的態(tài)勢(shì)。而對(duì)HBC-2和HBC-3來(lái)說(shuō)，雖然比HBC-0和HBC-1略有降低，但也呈現(xiàn)一樣的趨勢(shì)。而之所以細(xì)胞存活率有些許降低，可能是輻照過(guò)程中所產(chǎn)生的含羰基以及羥基的產(chǎn)物給細(xì)胞帶來(lái)影響，而在相同的情況下，對(duì)比PEI組，它們的毒性非常驚人。PEI組即使在只有1μg/mL濃度下，大部分的細(xì)胞都會(huì)被殺死，假如PEI的濃度達(dá)到10μg/mL，那么，大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)死亡，只剩下10%左右的細(xì)胞。這樣的對(duì)比，也有力地體現(xiàn)了HBC作為生物材料的低細(xì)胞毒性，比起劇毒的PEI有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3討論

本文研究結(jié)果表明，羥丁基殼聚糖作為一種殼聚糖的衍生物，在具備溫敏等其他功能的同時(shí)，輻射相關(guān)的性質(zhì)依然比較優(yōu)秀。雖然在輻照過(guò)程中，分子量會(huì)有少量的降低，但是如果輻照過(guò)程的吸收劑量不大的話，分子量降低程度較小。此外，HBC輻照之后的產(chǎn)物，依然具有非常低的細(xì)胞毒性，不會(huì)干擾Hela細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。因此，HBC作為一種溫敏型生物材料的應(yīng)用是比較可靠的。

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