董浩垚，侯俊德，遲曉慧，王曉微，趙廣平，陳永學(xué)

(1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056008； 2.邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056008)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是患者在手術(shù)及麻醉后出現(xiàn)的記憶力減退、判斷和解決問(wèn)題能力降低、注意力難以集中等以認(rèn)知功能缺失為主的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，輕者僅影響認(rèn)知功能及情緒，嚴(yán)重者可喪失獨(dú)立自主能力[1]。相關(guān)研究顯示，高達(dá)60%的心臟、骨科等大手術(shù)患者及25.8%的非心臟等手術(shù)患者可于術(shù)后1周內(nèi)發(fā)生認(rèn)知功能障礙[2]。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)停止注射全身麻醉藥物后，麻醉效果雖能在短時(shí)間內(nèi)消除，但對(duì)大腦造成的形態(tài)學(xué)及功能改變?cè)诙唐趦?nèi)無(wú)法修復(fù)，大部分麻醉藥物可通過(guò)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同作用區(qū)域而影響認(rèn)知功能，導(dǎo)致短期內(nèi)學(xué)習(xí)及記憶能力降低以及逆行性或順行性遺忘等不良反應(yīng)[3-4]。周彤[5]研究顯示，咪達(dá)唑侖可通過(guò)抑制海馬CA1區(qū)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ蛋白的表達(dá)影響學(xué)習(xí)記憶能力；而覃思平等[6]研究顯示，右美托咪定可通過(guò)抑制核因子κB通路多種相關(guān)因子的表達(dá)而降低海馬區(qū)炎癥反應(yīng)程度，進(jìn)而對(duì)認(rèn)知功能起到保護(hù)作用。本研究主要探討右美托咪定對(duì)咪達(dá)唑侖麻醉所致認(rèn)知障礙的保護(hù)作用及其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只無(wú)特定病原體級(jí)成年雄性SD大鼠，8～10周齡，體重250～350 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-0008，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食水。本研究獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)要求。

1.1.2試劑與儀器 鹽酸右美托咪定注射液(批號(hào)：20190601)、咪達(dá)唑侖注射液(批號(hào)：20191203)(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)；蛋白裂解液及酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,批號(hào)：20191017)；Morris水迷宮(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；高速低溫離心機(jī)(CR-GIII/CR22N)(日本Hitachi公司)；酶標(biāo)儀(Epoch)(美國(guó)Hologic公司)；電泳儀(EPS-300)(上海天能科技有限公司)；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(ZF-258)(上海嘉鵬科技有限公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiScope 6000)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.2模型建立及分組 將120只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、咪達(dá)唑侖組、右美托咪定50 μg/kg組、右美托咪定75 μg/kg組，各30只，每組大鼠隨機(jī)分為2個(gè)亞組，分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(15只)與蛋白含量檢測(cè)(15只)。正常對(duì)照組大鼠正常進(jìn)食水，不給予任何藥物處理；咪達(dá)唑侖組大鼠腹腔注射50 mg/kg咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)麻醉，并于翻正反射開(kāi)始恢復(fù)時(shí)追加首劑量的50%，維持麻醉2 h，期間保證大鼠自主呼吸，注意保暖；右美托咪定50、75 μg/kg組腹腔注射50 mg/kg咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)麻醉，并于翻正反射開(kāi)始恢復(fù)時(shí)追加首劑量的50%，維持麻醉2 h，麻醉結(jié)束前30 min腹腔分別注射50、75 μg/kg右美托咪定，期間保證大鼠自主呼吸，注意保暖。每組大鼠每日麻醉1次，連續(xù)麻醉7 d。以大鼠前爪不能自行翻轉(zhuǎn)為俯臥位且維持時(shí)間10 s以上作為大鼠前爪翻正反射消失標(biāo)準(zhǔn)，即麻醉起效，造模成功，本研究大鼠均造模成功。

1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)及記憶能力 將水迷宮置于光線較暗的安靜房間內(nèi)，水池分為4個(gè)象限，每個(gè)象限各掛一個(gè)獨(dú)特的指示標(biāo)志物；水中加入適量碳染黑劑，使水變成不透明黑色；第三象限中央放置平臺(tái)，且平臺(tái)低于水面2 cm；每次實(shí)驗(yàn)前先將水池內(nèi)的水加熱至24 ℃左右。實(shí)驗(yàn)前1天，將大鼠放于水池內(nèi)適應(yīng)性游泳3～5 min；然后分別于麻醉第1、3、5、7天待大鼠麻醉清醒后行定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)能力，麻醉第7天行空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)定記憶能力。

定位航行：分別從4個(gè)象限相同位置將大鼠面朝池壁放入水中，記錄大鼠登上隱蔽平臺(tái)所用時(shí)間(即逃避潛伏期)，并讓大鼠在平臺(tái)上停留15 s(若120 s內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，由研究人員協(xié)助其找到平臺(tái)，將所用時(shí)間記為120 s)，4次時(shí)間的均值作為當(dāng)天成績(jī)。

空間探索：水池內(nèi)平臺(tái)撤除，自距離第三象限最遠(yuǎn)的象限，即第一象限內(nèi)在原池壁位置將大鼠面朝池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠穿越原第三象限平臺(tái)位置次數(shù)以及在第三象限的停留時(shí)間，計(jì)算在第三象限停留比率。

1.4Western Blot法檢測(cè)磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2)、磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein,p-CREB)水平 分別于麻醉第3、5、7天各組隨機(jī)選取5只大鼠斷頭處死后，自錐孔開(kāi)始用手術(shù)剪縱向剪開(kāi)頭蓋骨，并應(yīng)用齒鑷進(jìn)行剝離，暴露腦組織；繼而用低溫0.9%氯化鈉溶液沖洗后，將腦組織取出，并迅速在冰上分離海馬組織，置入滅菌凍存管內(nèi)標(biāo)記，液氮冰凍后-80 ℃冰箱保存。稱取20 mg海馬組織標(biāo)本，加入200 μL裂解液裂解，勻漿器充分研磨，4 ℃環(huán)境下12 000×g離心5 min，提取總蛋白，二辛可寧酸法測(cè)定總蛋白濃度；取蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚偏氟乙烯轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后，分別加入p-ERK1/2、p-CREB一抗4 ℃孵育過(guò)夜；封閉-洗滌緩沖液洗滌3次，加入二抗，室溫孵育2 h；封閉-洗滌緩沖液洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光顯影；Image J圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)間逃避潛伏期比較 麻醉第1、3、5、7天大鼠逃避潛伏期的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；不考慮測(cè)量時(shí)間，各組間逃避潛伏期的主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；組間和時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.01)，麻醉第3、5、7天各組大鼠逃避潛伏期呈下降趨勢(shì)，咪達(dá)唑侖組、右美托咪定50 mg/kg組、右美托咪定75 mg/kg組逃避潛伏期均長(zhǎng)于正常對(duì)照組，右美托咪定50 mg/kg組和右美托咪定75 mg/kg組均短于咪達(dá)唑侖組，右美托咪定75 mg/kg組短于右美托咪定50 mg/kg組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)間逃避潛伏期比較

2.2各組大鼠越臺(tái)位次數(shù)及停留比率比較 麻醉第7天各組大鼠穿越平臺(tái)位置次數(shù)及停留在第三象限時(shí)間比率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，咪達(dá)唑侖組、右美托咪定50 mg/kg組、右美托咪定75 mg/kg組越臺(tái)位次數(shù)少于正常對(duì)照組，右美托咪定50 mg/kg組和右美托咪定75 mg/kg多于咪達(dá)唑侖組，右美托咪定75 mg/kg組多于右美托咪定50 mg/kg組(P<0.05)；咪達(dá)唑侖組、右美托咪定50 mg/kg組、右美托咪定75 mg/kg組停留比率低于正常對(duì)照組，右美托咪定50 mg/kg組和右美托咪定75 mg/kg高于咪達(dá)唑侖組，右美托咪定75 mg/kg組高于右美托咪定50 mg/kg組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平比較 麻醉第3、5、7天各組大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，咪達(dá)唑侖組、右美托咪定50 mg/kg組、右美托咪定75 mg/kg組p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，右美托咪定50 mg/kg組和右美托咪定75 mg/kg高于咪達(dá)唑侖組，右美托咪定75 mg/kg組高于右美托咪定50 mg/kg組(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組大鼠p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

學(xué)習(xí)記憶能力是大腦最重要的生理功能，是人類工作、生活等活動(dòng)及生存最基本的技能，也是認(rèn)知功能最主要的表現(xiàn)形式[7-8]。研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與信息傳遞效率相關(guān)的突觸功能及與信息儲(chǔ)存相關(guān)的突觸結(jié)構(gòu)的高度可塑性是學(xué)習(xí)和記憶功能最主要的生理學(xué)基礎(chǔ)，改變突觸可塑性可影響學(xué)習(xí)記憶功能[9]，且海馬是執(zhí)行學(xué)習(xí)及記憶功能的重要部位，不僅參與陳述性記憶，還涉及認(rèn)知功能和位置導(dǎo)航，在訊息的空間儲(chǔ)存和處理中具有重要作用[10]。部分研究證實(shí)，多種麻醉藥物可通過(guò)調(diào)控p-ERK及環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A-CREB-腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路活性而影響認(rèn)知功能[11-12]。

p-ERK1/2：磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；p-CREB：磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白

綜上所述，右美托咪定可改善咪達(dá)唑侖引起的大鼠認(rèn)知功能損害癥狀，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)腺苷酸/蛋白激酶A-CREB-腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路中p-ERK1/2及p-CREB等的表達(dá)保護(hù)大鼠認(rèn)知功能。