張 陽 呂慧源 徐盛玉 方正鋒 馮 斌 車煉強 林 燕 卓 勇 李 健 江雪梅 趙希侖 吳 德*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都611130；2.北京生泰爾生物科技股份有限公司，北京102600)

在非洲豬瘟和飼料禁抗的大環(huán)境下，開展保健類飼料添加劑的研究對維持并提高動物的生產(chǎn)性能、增強動物自身健康狀況有著重要意義，成為動物營養(yǎng)學近年來的研究熱點。其中，復合益生菌制劑和黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)是2類研究應(yīng)用相對成熟的動物保健產(chǎn)品，它們組成的合生元的應(yīng)用效果也引起一些學者的關(guān)注。李樹鵬[1]研究發(fā)現(xiàn)，APS與益生菌組成的合生元對有害菌的抑制效果比單一添加更為顯著；但合生元對雛雞生長性能的提高并不比單一添加效果好。其后，部分在雞上的研究表明，復合益生菌與APS組成的合生元較對照組和單一添加組對雞的生產(chǎn)性能、免疫等方面均具有一定優(yōu)勢[2-5]。岑路等[6]在仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，索比亞益生菌具有顯著的防治口蹄疫和提高口蹄疫疫苗保護的作用，同時還促進了仔豬的生長，且添加APS與其有明顯的協(xié)同作用。前人研究多直接關(guān)注復合益生菌與APS組成的合生元的應(yīng)用效果，且主要關(guān)注生產(chǎn)性能和免疫這2個方面，這使得我們目前對于復合益生菌與APS之間相互作用的了解知之甚少。作為合生元重要組成的益生菌，其重要作用之一便是調(diào)節(jié)動物腸道微生物，而前人研究卻較少關(guān)注這方面的影響。同時，在生長育肥豬上復合益生菌與APS混合使用效果的研究國內(nèi)未見報道。因此，本研究將著重考察復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能、血清生化指標和糞便微生物的影響，為復合益生菌與APS在生長育肥豬上互作效應(yīng)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復合益生菌制劑購于某公司，有效成分為枯草芽孢桿菌、嗜乳酸桿菌和屎腸球菌，活菌數(shù)>5×108CFU/g。APS來源于某公司，有效成分及含量為：黃芪多糖200 mg/g，黃芩苷22 mg/g，綠原酸2.2 mg/g。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用2×2雙因素試驗設(shè)計，選取80頭健康狀況、體重[(33.5±0.8) kg]相近的“杜×長×大”生長豬，隨機分為4組(每組5個重復，每個重復4頭豬)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)、基礎(chǔ)飼糧+5×108CFU/kg復合益生菌(復合益生菌組)、基礎(chǔ)飼糧+0.1%APS(APS組)、基礎(chǔ)飼糧+5×108CFU/kg復合益生菌+0.1%APS(復合益生菌+APS組)。試驗期為84 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

試驗用基礎(chǔ)飼糧為參照NRC(2012)25～110 kg生長育肥豬營養(yǎng)需要配制的粉狀配合飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items第1～28天Day 1 to 28第29～56天Day 29 to 56第57～84天Day 57 to 84營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)消化能 DE/(MJ/kg)14.4414.4014.61粗蛋白質(zhì) CP17.1015.5414.85粗脂肪 EE4.904.805.74粗灰分 Ash4.073.933.90鈣 Ca0.690.680.60總磷 TP0.490.480.42有效磷 AP0.320.310.26可消化賴氨酸 DLys1.141.000.87可消化蛋氨酸 DMet0.320.290.25可消化蛋氨酸+可消化半胱氨酸 DMet+DCys0.920.530.77可消化蘇氨酸 DThr0.720.640.57可消化色氨酸 DTrp0.220.190.17

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所動物試驗農(nóng)場進行。圈舍消毒后轉(zhuǎn)入試驗豬只，分組分重復關(guān)好，同一重復豬只關(guān)在同一個圈中。每天飼喂3次(08：00、14：00和20：00)，使豬只全期自由采食，充足飲水，給予豬只適宜的生長環(huán)境，豬舍定期消毒。

1.5 樣品采集

1.5.1 血樣

試驗第85天清晨每個重復隨機選取1頭健康的豬，空腹采血5 mL于普通采血管中，靜置2 h后于3 000 r/min離心10 min，將血清分裝于1.5 mL離心管中，于-20 ℃保存待測。

1.5.2 糞樣

試驗第84天，每個重復隨機選取2頭豬使用一次性無菌手套采集糞便樣品，每頭豬采糞30 g左右。每頭豬的糞樣分裝于4支已滅菌的凍存管中，-80 ℃保存待測，剩余糞樣棄置。

1.6 指標檢測

1.6.1 生長性能

試驗期間每周結(jié)料，準確記錄每個重復豬只的采食量，試驗第28天、第56天和第84天晚上空腹稱重，計算豬的平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)和料重比(feed/gain,F/G)。

1.6.2 血清生化指標

采用南京建成生物工程研究所的生化試劑盒，結(jié)合酶標儀測定血清樣品中白蛋白(albumin,ALB)、尿素氮(urea nitrogen,UN)和總膽汁酸(total bile acid,TBA)的含量。

1.6.3 糞便微生物

1.6.3.1 微生物多樣性測定

將糞便樣品整理好后，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行環(huán)境微生物測序，測序完成后在美吉生物云平臺上進行微生物多樣性分析。

1.6.3.2 微生物代謝產(chǎn)物測定

短鏈脂肪酸：采用氣相色譜儀(瓦里安MP-3800型)測定糞便樣品中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

先使用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SAS 9.2對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和雙因素方差分析。正態(tài)性和方差同質(zhì)性分別通過Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗進行評估。如果2個因素之間不存在交互作用，進行主效應(yīng)分析；如果2個因素之間存在交互作用，則進行簡單主效應(yīng)分析。結(jié)果以平均值(mean)和集合標準誤(SEM)的形式表示。以P<0.01作為極顯著性差異，P<0.05作為顯著性差異，0.05≤P<0.10作為趨勢性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，復合益生菌組、APS組和復合益生菌+APS組生長育肥豬第1～28天、第57～84天及第1～84天ADFI、ADG和F/G均無顯著差異(P>0.05)；第29～56天，飼糧添加復合益生菌有提高生長育肥豬ADFI的趨勢(P=0.065)，且顯著提高生長育肥豬F/G(P<0.05)。

表2 復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能的影響

2.2 復合益生菌與APS對生長育肥豬血清生化指標的影響

由表3可知，各組生長育肥豬血清生化指標均無顯著差異(P>0.05)。

表3 復合益生菌與APS對生長育肥豬血清生化指標的影響

2.3 復合益生菌與APS對生長育肥豬糞便微生物的影響

2.3.1 α多樣性分析

由表4可知，各組操作分類單元(operational taxonomicunit，OTU)序列的覆蓋率(coverage)均達到了0.99，說明得到的OTU序列對于試驗結(jié)果具有代表性；其中，與對照組相比，飼糧添加APS顯著降低了生長育肥豬糞便微生物的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)(P<0.05)。

表4 生長育肥豬糞便微生物α多樣性分析

2.3.2 門水平

由表5可知，經(jīng)檢測，在本試驗采集的生長育肥豬糞便樣本中，除門水平上未命名的菌群外，相對豐度大于0.1%的門共有7個，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和WPS-2門(WPS-2)。結(jié)果顯示，與對照組相比，飼糧添加復合益生菌有降低生長育肥豬糞便樣品中厚壁菌門相對豐度的趨勢(P=0.071)，有提高擬桿菌門相對豐度的趨勢(P=0.061)，有降低厚壁菌門/擬桿菌門值的趨勢(P=0.050)。

表5 生長育肥豬糞便微生物主要菌群門水平上的相對豐度

2.3.3 屬水平

由表6可知，經(jīng)檢測，在本試驗采集的生長育肥豬糞便樣本中，除屬水平上未命名的菌群外，共檢測到63種不同屬的微生物，相對豐度大于1%的屬共有15個，分別為：狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、鏈球菌屬(Streptococcus)、Terrisporobacter、乳桿菌屬(Lactobaillus)、Muribaculaceae、瘤胃球菌科UCG-005屬(Ruminococcaceae_UCG-005)、克里斯滕森菌科R-7群屬(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、毛螺菌科XPB1014群屬(Lachnospiraceae_XPB1014_group)、顫螺旋菌科NK4A214群屬(Oscillospiraceae_NK4A214_group)、普雷沃氏菌科NK3B31群屬(Prevotellaceae_NK3B31_group)、瘤胃球菌科UCG-014屬(Ruminococcaceae_UCG-014)、理研菌科RC9腸道群屬(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、密螺旋體屬(Treponema)和瘤胃球菌科UCG-002屬(Ruminococcaceae_UCG-002)。結(jié)果顯示，與對照組相比，飼糧添加APS顯著降低生長育肥豬糞便樣品中顫螺旋菌科NK4A214群屬相對豐度(P<0.05)；復合益生菌與APS對糞便樣品中毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度存在互作效應(yīng)(P<0.05)，與對照組相比，復合益生菌組和APS組毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，而與復合益生菌組和APS組相比，復合益生菌+APS組毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度顯著降低(P<0.05)；復合益生菌與APS對糞便樣品中乳桿菌屬相對豐度存在互作效應(yīng)趨勢(P=0.071)，與對照組相比，飼糧不添加APS時，復合益生菌組糞便樣品中乳桿菌屬相對豐度有下降趨勢(P=0.071)。

表6 生長育肥豬糞便微生物主要菌群屬水平上的相對豐度

圖1 生長育肥豬糞便微生物厚壁菌門和

2.4 復合益生菌與APS對生長育肥豬糞中短鏈脂肪酸含量的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧添加復合益生菌極顯著降低生長育肥豬糞中乙酸和丙酸的含量(P<0.01)，同時顯著降低糞中丁酸的含量(P<0.05)。

表7 復合益生菌與APS對生長育肥豬糞中短鏈脂肪酸含量的影響

3 討 論

3.1 復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能的影響

研究表明，益生菌可提高動物日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[7]?？莶菅挎邨U菌可以分泌多種促進消化的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，并能夠在代謝過程中產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)(維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、促生長因子和有機酸等)，進而促進對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[8]。乳酸菌可以通過發(fā)酵碳水化合物來形成乳酸，從而調(diào)節(jié)動物腸道的pH，并激發(fā)胃蛋白酶加強胃腸的蠕動，以此來提高動物機體的消化能力[9]。復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能互作效應(yīng)的研究目前未見報道，但岑路等[6]使用名為“索比亞益生菌”的益生菌制劑與APS在斷奶仔豬上的研究表明，索比亞益生菌對斷奶仔豬的生長有良好的促進作用，且添加APS與其具有明顯的協(xié)同作用。此外，李樹鵬[1]在雛雞上的研究表明，合生元對雛雞生長性能的提高并不比單一添加效果好。本試驗結(jié)果顯示，復合益生菌與APS對生長育肥豬各時間段生長性能無互作效應(yīng)；第29～56天，飼糧添加復合益生菌通過提高生長育肥豬ADFI，從而顯著提高其F/G。而李浩等[10]在生長育肥豬的研究則發(fā)現(xiàn)，在85～104日齡階段，復合益生菌組的ADG和ADFI顯著低于對照組，這于本研究結(jié)果不一致。

圖2 生長育肥豬糞便微生物乳桿菌屬、 毛螺菌科XPB1014群屬和顫螺旋菌科 NK4A214群屬的相對豐度

3.2 復合益生菌與APS對生長育肥豬血清生化指標的影響

白蛋白和球蛋白含量反映機體蛋白質(zhì)代謝情況。杜泓明等[11]通過試驗發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加益生菌能夠一定程度上提高仔豬血液中總蛋白和白蛋白的含量。膽汁酸分子內(nèi)既含親水性的羥基和羧基，又含疏水性的甲基及烴核，故具有兩親性，可以通過膠束的形成促進腸道對食物中脂類和脂溶性維生素的消化吸收，從而對脂代謝發(fā)揮調(diào)控作用[12]。在動物機體內(nèi)，蛋白質(zhì)通過一系列代謝的最終產(chǎn)物是尿素氮，通常人們將血液尿素氮的指標作為斷定機體蛋白質(zhì)代謝與氨基酸平衡的依據(jù)[13]。白雅綺[14]研究表明，各組育肥豬血清中白蛋白、尿素氮含量等生化指標差異不顯著，說明飼糧可溶性纖維和益生菌不影響育肥豬血清生化指標。本試驗研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

3.3 復合益生菌與APS對生長育肥豬糞便微生物和短鏈脂肪酸含量的影響

動物腸道是動物體內(nèi)的消化器官和免疫器官，腸道中定植的微生物在動物消化吸收和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著巨大作用。添加中草藥、益生菌等可以改變宿主的腸道菌群結(jié)構(gòu)[15]，進而影響動物消化吸收和健康。

α多樣性指數(shù)可以反映樣品微生物群落的豐富度和多樣性。Shannon指數(shù)反映群落物種的多樣性；Simpson指數(shù)綜合考量樣本中物種的豐富性和均勻度；Ace指數(shù)用于估算還沒被發(fā)現(xiàn)的物種的數(shù)量；Chao1指數(shù)判斷群落的物種豐富度；coverage為各組測序時發(fā)現(xiàn)的OTU序列的覆蓋率[16]。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加APS顯著降低生長育肥豬糞便微生物的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)，表明APS降低了糞便微生物的豐富度。這可能跟APS的抑菌功能有關(guān)，李樹鵬[1]的APS體外抑菌試驗結(jié)果表明，50、100和200 μL 0.1%的APS水溶液對2株益生菌(乳酸菌和芽孢桿菌)和3株致病菌(葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌)均有抑制作用。

本試驗中，生長育肥豬糞便微生物門水平上的主要菌群為厚壁菌門和擬桿菌門，厚壁菌門與擬桿菌門主要通過酵解動物體內(nèi)的營養(yǎng)成分而參與機體新陳代謝。相對擬桿菌門，厚壁菌門能產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸和脂質(zhì)產(chǎn)物，從而促進機體脂質(zhì)的沉積[17-18]，厚壁菌門/擬桿菌門值也是衡量動物機體脂質(zhì)沉積和生產(chǎn)性能的標志之一[19-21]。白雅綺[14]研究表明，在低可溶性纖維飼糧中添加益生菌可顯著提高試驗豬糞便樣品中厚壁菌門相對豐度，降低擬桿菌門相對豐度，說明飼糧中添加益生菌可促進育肥豬的脂質(zhì)沉積。但Koceak等[22]在研究了50個肥胖患者與30個正常人的腸道菌群后發(fā)現(xiàn)，肥胖患者的腸道菌群多樣性增加，而厚壁菌門/擬桿菌門值卻沒有明顯增加。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加復合益生菌有降低厚壁菌門相對豐度和提高擬桿菌門相對豐度以及降低厚壁菌門/擬桿菌門值的趨勢，這與前人研究結(jié)果均不盡相同，由此看來，通過改變厚壁菌門與擬桿菌門的比值來影響肥胖或脂質(zhì)沉積的作用還需進一步研究。

乳桿菌屬為腸道有益菌，可以促進大分子蛋白和乳糖的分解，生成有利于機體的小分子肽、氨基酸和乳酸，還可抑制有害菌繁殖，維護腸道微生態(tài)平衡[14]。目前，益生菌制劑對動物益生作用的主流觀點是益生菌可以增加動物體內(nèi)有益菌數(shù)量，維持腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)腸道免疫并提高生長性能。本研究中，復合益生菌與APS對生長育肥豬糞便中乳桿菌屬相對豐度存在互作趨勢，表現(xiàn)在飼糧不添加APS時，復合益生菌組糞便樣品中乳桿菌屬相對豐度有下降趨勢，這與主流觀點不一致。李浩等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，試驗中果寡糖組的乳桿菌相對豐度最高，而復合益生菌組和合生元組的乳桿菌相對豐度則較低，并認為其原因可能是復合益生菌的添加抑制了乳桿菌的生長，但目前并無相關(guān)研究報道證實這一說法。筆者認為，這與益生菌的不穩(wěn)定性有關(guān)。在益生菌制劑中，發(fā)揮作用的不止是活菌，死菌和益生菌的代謝產(chǎn)物也具有一定的生物學功能，不過目前專門針對這2種成分的研究較少。目前對于益生菌制劑有效成分含量的評價標準一般是出廠時的活菌數(shù)，但其中的活菌在保存和在動物胃中消化時極易失活，從而導致真正到達腸道特定部位進行定植的益生菌極少。此外，包括本研究在內(nèi)的關(guān)于益生菌的大量研究在添加益生菌時，為減少工作量，均通過在動物基礎(chǔ)飼糧中添加一定量的益生菌進行飼喂，而不是在每次飼喂時通過拌料的形式添加，因此由于混入飼糧益生菌的保存條件大打折扣，影響益生菌的活性，這就使得平均分布到每一口飼糧的益生菌雖通過長期飼喂，其中的活菌、死菌、代謝產(chǎn)物對免疫、生長性能存在一定的效果，但卻因為外來活菌無法在短期內(nèi)達到一定數(shù)量以成為優(yōu)勢菌群，導致有幸進入動物腸道的外來活菌在腸道中定植困難，進而也難以通過定植影響相應(yīng)的微生物結(jié)構(gòu)。顫螺旋菌科NK4A214群屬目前作用尚不明確，故在此不做討論。毛螺菌科對病原菌具有拮抗作用[23]，本研究結(jié)果顯示，飼糧單獨添加復合益生菌或APS時，復合益生菌組和APS組生長育肥豬糞便中毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度顯著提高，而與復合益生菌組和APS組相比，復合益生菌+APS組毛螺菌科XPB1014群屬相對豐度顯著降低，這表明飼糧單獨添加復合益生菌或APS可以通過提高毛螺菌科分類下XPB1014群屬的相對豐度來抑制有害菌的生長，但復合益生菌和APS同時添加會引起反向的效果。

短鏈脂肪酸是未消化的食物殘渣在后腸經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[24]，參與宿主的能量代謝和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化[25-26]，它們的主要產(chǎn)生菌為毛螺旋菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬等[24，27]。王漢星等[28]研究表明，飼糧添加枯草芽孢桿菌能顯著提高糞便中短鏈脂肪酸的含量和乳桿菌的相對豐度。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加復合益生菌極顯著降低生長育肥豬糞中乙酸和丙酸的含量，同時顯著降低生長育肥豬糞中丁酸的含量，這與前人研究結(jié)果不一致，原因可能與本研究中梭菌屬、乳桿菌屬等短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的相對豐度降低有關(guān)。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下：

① 飼糧添加復合益生菌通過提高生長育肥豬ADFI，從而顯著提高相應(yīng)F/G，同時降低糞便中厚壁菌門/擬桿菌門值及短鏈脂肪酸含量；

② 飼糧添加APS顯著降低了生長育肥豬糞便微生物的多樣性；

③ 復合益生菌與APS對生長育肥豬生長性能和血清生化指標無互作效應(yīng)，對生長育肥豬糞便微生物中的毛螺菌科XPB1014群屬的相對豐度存在互作效應(yīng)，但表現(xiàn)為拮抗作用。