馬 勇 李方方 張 勇 張瑞陽 朱宇旌

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽110866)

動(dòng)物的生長發(fā)育受神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而飼糧中添加外源性激素可通過調(diào)控神經(jīng)-內(nèi)分泌而提高動(dòng)物生長性能，但畜產(chǎn)品藥物殘留等問題直接危害人類健康和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展[1]。研究表明，異黃酮有弱雌激素作用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗氧化、提高動(dòng)物繁殖機(jī)能和生長性能等一系列重要的生物學(xué)功能[2-3]，且對調(diào)節(jié)新陳代謝、預(yù)防骨質(zhì)疏松[4-5]和癌癥[6]方面具有特殊功效。因此，開發(fā)具有動(dòng)物激素樣活性的天然植物添加劑安全有效，且符合飼料綠色添加劑的開發(fā)趨勢。紅三葉草(TrifoliumpretenseL.)是豆科、三葉草屬多年生草本植物，為優(yōu)良豆科牧草，因具有較高的飼用價(jià)值而被廣泛栽培。紅三葉草富含多種異黃酮類化合物，且含量較高，具有大多數(shù)異黃酮6倍以上的雌激素樣活性，開發(fā)其在動(dòng)物飼糧中的應(yīng)用具有價(jià)格和資源優(yōu)勢。因此，本試驗(yàn)以去卵巢雌性SD大鼠為模型動(dòng)物，研究紅三葉異黃酮對大鼠生長性能、血清激素指標(biāo)和子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以期為紅三葉異黃酮作為新型飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖及紅三葉牧草資源的充分開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

試驗(yàn)動(dòng)物：體重(200±5) g、3月齡的健康SD雌性大鼠30只(遼寧本溪長生生物有限公司提供)，整個(gè)飼養(yǎng)過程在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)無特定病原體(SPF)級動(dòng)物試驗(yàn)中心進(jìn)行。

試驗(yàn)材料：紅三葉異黃酮，純度80%，西安小草有限公司提供；其中，芒柄花素含量54%，鷹嘴豆芽素A(雞豆黃素)含量12%，大豆素含量8%，染料木素含量7%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選用30只體重(200±5) g、3月齡的SPF級雌性SD大鼠，預(yù)飼1周后隨機(jī)分為5組(每組6只)，分別為假手術(shù)組(手術(shù)但未切除卵巢)、對照組(切除卵巢)以及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組[分別按體重灌胃10、30和100 mg/(kg·d)紅三葉異黃酮]。用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液將紅三葉異黃酮配制成所需濃度，每只灌胃4 mL/d；對照組和假手術(shù)組灌胃等量的0.5% CMC-Na溶液。對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠采用腹腔注射1.5 mL“速眠新”進(jìn)行麻醉，實(shí)施脊柱雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，摘除卵巢后縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組大鼠麻醉后暴露卵巢，用鑷子碰觸卵巢表面后縫合創(chuàng)口。手術(shù)后清潔手術(shù)區(qū)域，使用青鏈霉素進(jìn)行消炎，隨后將所有大鼠放回飼養(yǎng)籠中小心護(hù)理，恢復(fù)14 d。

SPF級大鼠飼糧由沈陽前民動(dòng)物飼料廠提供，可滿足大鼠的營養(yǎng)需要。所有大鼠自由采食，自由飲水，室溫保持在(23±2) ℃，每天12 h光照、12 h黑暗，相對濕度保持在45%左右，其他日常飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行。

1.3 樣品采集與處理

手術(shù)后恢復(fù)14 d，連續(xù)灌胃21 d，第22天早晨采用頸部斷頭法處死大鼠，迅速剖開腹腔采集子宮，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，放入10%甲醛溶液中固定，待做石蠟切片。同時(shí)收集血液，室溫靜置3 h后，1 500 r/min離心15 min分離血清，血清分裝于離心管中于4 ℃冰箱中保存，待分析。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定

試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日對各組大鼠進(jìn)行空腹稱重，記錄各組大鼠的飼糧采食量，并以重復(fù)為單位進(jìn)行計(jì)算；統(tǒng)計(jì)各組大鼠的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)。

1.4.2 血清激素及鈣、磷含量測定

血清甲狀腺素(T4)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)含量均采用放射免疫分析方法進(jìn)行測定；血清生長激素(GH)含量采用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行測定；血清鈣(Ca)和磷(P)含量采用比色法進(jìn)行測定。試驗(yàn)中所使用的試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.4.3 子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)

取約1 cm3的組織小塊，經(jīng)10%甲醛溶液固定48 h，固定后樣本經(jīng)沖洗→梯度酒精脫水→透明→浸蠟與包埋→修蠟塊與切片→脫蠟到水化→蘇木精-伊紅(HE)染色→中性樹膠封固等處理后，制成石蠟切片。進(jìn)行連續(xù)切片時(shí)，切片厚度為5 μm。在光學(xué)顯微鏡40倍下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍攝照片，比較各組大鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步整理后采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠生長性能的影響

如表1所示，低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的平均日采食量均顯著高于對照組(P<0.05)；其中，高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的平均日采食量最高(18.27 g)，并顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；而中劑量紅三葉異黃酮組與低劑量紅三葉異黃酮組之間大鼠的平均日采食量差異不顯著(P>0.05)，且與假手術(shù)組接近但差異不顯著(P>0.05)。

表1 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠生長性能的影響

對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的平均日增重均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；且低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)，高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的平均日增重顯著高于低和中劑量紅三葉異黃酮組(P<0.05)。

對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的料重比均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；且低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的料重比均顯著低于對照組(P<0.05)；高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的料重比低于低和中劑量紅三葉異黃酮組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清生殖相關(guān)激素指標(biāo)的影響

如表2所示，假手術(shù)組和低劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清E2含量顯著高于對照組(P<0.05)，而中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清E2含量與對照組和假手術(shù)組無顯著差異(P>0.05)。

表2 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清生殖相關(guān)激素指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清FSH含量均有不同程度提高，其中，高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清FSH含量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，而其余各組間均差異不顯著(P>0.05)。

假手術(shù)組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清LH含量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中，中劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清LH含量顯著高于其余各組(P<0.05)。

2.3 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清生長相關(guān)激素指標(biāo)的影響

如圖1所示，高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清GH含量顯著高于對照組、假手術(shù)組和低劑量紅三葉異黃酮組(P<0.05)。低劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清T4含量顯著高于其余各組(P<0.05)，而其余各組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清鈣和磷含量的影響

如圖2所示，與假手術(shù)組相比，對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清中鈣和磷含量均顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清鈣含量均有所提高，其中，低劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清鈣含量顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，大鼠血清磷含量隨紅三葉異黃酮?jiǎng)┝康纳叨饾u降低，其中，低劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清磷含量顯著高于對照組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清鈣和磷含量的影響

2.5 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，對照組大鼠的子宮出現(xiàn)萎縮、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疏松，缺乏結(jié)締組織，肌層變薄，平滑肌和結(jié)締組織走形紊亂，子宮腺體不清晰，內(nèi)膜脫落不完整。假手術(shù)組大鼠的子宮平滑肌和結(jié)締組織發(fā)育正常，各級腺體未見管腔擴(kuò)張，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈長形，單層排列，且大部分細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，處于分裂期，子宮內(nèi)膜固有層細(xì)胞排列整齊，呈紡錘形。而與對照組相比，紅三葉異黃酮處理使大鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)有不同程度地修復(fù)。其中高劑量紅三葉異黃酮組外膜結(jié)締組織結(jié)構(gòu)較正常，肌層腺體無明顯增大，管壁較厚，管腔較小，內(nèi)膜柱狀上皮有所改變，修復(fù)較好。中劑量紅三葉異黃酮組外膜結(jié)締組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，肌層平滑恢復(fù)較好，內(nèi)膜仍有增厚部位，修復(fù)不完整。低劑量紅三葉異黃酮組外膜結(jié)締組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肌層平滑排列不整，形態(tài)結(jié)構(gòu)與內(nèi)膜仍有增厚，間質(zhì)細(xì)胞排列整齊，染色質(zhì)濃縮呈紡錘結(jié)構(gòu)。

圖3 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠生長性能的影響

異黃酮類化合物作為一種潛在的綠色飼料添加劑資源在改善動(dòng)物的生長性能方面具有很大的研究前景。作為外源性激素樣活性物質(zhì)，異黃酮可與動(dòng)物下丘腦、垂體E2受體結(jié)合，影響動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的性腺軸和生長軸，進(jìn)而提高動(dòng)物生長性能。研究發(fā)現(xiàn)，灌胃大豆異黃酮可顯著提高大鼠心肌和腓腸肌肌纖維的直徑[7]。飼糧中添加大豆異黃酮能改善肉雞的生長性能，降低料重比[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠平均日增重與紅三葉異黃酮的灌胃劑量呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，這與之前的研究結(jié)果[7,9]一致。其中，灌胃10、30和100 mg/(kg·d)紅三葉異黃酮的大鼠平均日增重分別比對照組提高了15.45%、17.44%和28.02%，分別比假手術(shù)組提高了24.97%、27.13%和38.58%，并且料重比顯著降低。

3.2 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清生殖相關(guān)激素指標(biāo)的影響

FSH和LH是垂體分泌的調(diào)節(jié)卵泡發(fā)生的2種主要蛋白質(zhì)激素，是參與卵巢功能調(diào)節(jié)的重要因子[10]。動(dòng)物生長發(fā)育到一定階段時(shí)，下丘腦對性腺類固醇激素的敏感性降低，使促性腺激素釋放激素的合成和分泌增加，同時(shí)腦垂體和性腺對促性腺激素釋放激素的敏感性增加，促進(jìn)FSH和LH分泌，后兩者作用于性腺促進(jìn)E2的分泌[11]。E2是調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育的重要激素之一，可通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長、分化以及多種細(xì)胞的功能[12]；雌性個(gè)體E2分泌不足是導(dǎo)致更年期綜合征出現(xiàn)的主要誘因，因此采用雌激素替代療法常成為預(yù)防更年期綜合征的主要治療手段，但雌激素本身可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜增生，誘發(fā)子宮癌[13]。研究表明，紅三葉異黃酮作為植物雌激素可替代E2，預(yù)防和緩解更年期綜合征的發(fā)生[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量紅三葉異黃酮組大鼠的血清FSH含量顯著高于假手術(shù)組，而其各余組大鼠的血清FSH含量與假手術(shù)組間無顯著差異；與對照組相比，灌胃紅三葉異黃酮可顯著提高大鼠血清LH含量。這說明灌胃紅三葉異黃酮可緩解去卵巢大鼠內(nèi)源激素分泌不平衡的狀況，部分彌補(bǔ)由于卵巢摘除所造成的雌性激素分泌不足的狀況，進(jìn)而改善動(dòng)物的生理機(jī)能。

3.3 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清生長相關(guān)激素指標(biāo)的影響

動(dòng)物的生長發(fā)育過程受多種激素的調(diào)節(jié)，其中GH和T4處于動(dòng)物生長軸的核心地位[9,15]。GH與靶細(xì)胞膜表面的GH受體結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)胰島素樣生長因子表達(dá)，再通過血液循環(huán)到達(dá)生物體局部組織，促進(jìn)多種組織生長，增強(qiáng)機(jī)體合成代謝，并與其他激素和生長因子共同作用，促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝和生長發(fā)育[1]。甲狀腺激素包括三碘甲狀腺原氨酸(T3)和T42種主要形式，對動(dòng)物生長、分化、發(fā)育和保持代謝平衡具有極其重要的作用，血液中甲狀腺激素主要以T4形式存在，由甲狀腺合成并釋放到血液中[16]。動(dòng)物飼喂異黃酮后，血清GH和T4含量變化可直接反映動(dòng)物的生長情況和代謝強(qiáng)度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組和假手術(shù)組相比，灌胃100 mg/(kg·d)的紅三葉異黃酮顯著提高了去卵巢大鼠的血清GH含量；而劉兆斌[7]研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠灌胃100 mg/(kg·d)大豆黃酮時(shí)，血清GH含量卻呈下降趨勢。此外，本試驗(yàn)中隨著紅三葉異黃酮?jiǎng)┝康奶岣?，大鼠血清T4含量呈現(xiàn)下降趨勢，而灌胃10 mg/(kg·d)紅三葉異黃酮的大鼠血清T4含量顯著高于對照組和假手術(shù)組。研究表明，甲狀腺功能亢進(jìn)伴有胰高血糖素升高，GH分泌增加等表型[13]。但在本試驗(yàn)中，灌胃異黃酮各組大鼠血清GH和T4含量變化趨勢呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而排除了甲狀腺激素分泌亢進(jìn)的可能性。綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃紅三葉異黃酮可通過影響大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的生長軸，調(diào)控GH和T4的分泌，進(jìn)而協(xié)同促進(jìn)大鼠的生長發(fā)育。

3.4 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠血清鈣和磷含量的影響

鈣和磷是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的礦物質(zhì)元素，占體重的1%～2%。作為機(jī)體鈣和磷的儲(chǔ)藏庫，98%～99%的鈣、80%的磷存在于骨骼和牙齒中。隨著年齡的增長，雌性動(dòng)物卵巢功能逐漸下降，雌激素分泌不足，誘發(fā)骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)軟化等癥狀[17]。在臨床上測定血清鈣和磷含量已作為診斷骨質(zhì)疏松癥的指標(biāo)[18]。此外，血清鈣和磷含量與動(dòng)物機(jī)體的許多重要代謝功能密切關(guān)，血清鈣和磷含量的測定對骨骼代謝的研究具有重要價(jià)值。本試驗(yàn)以去卵巢大鼠為研究對象，去卵巢大鼠是研究雌激素缺乏和模擬更年期女性綜合征的最佳動(dòng)物模型[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，對照組及低、中和高劑量紅三葉異黃酮組大鼠血清中鈣和磷含量均顯著下降；與對照組相比，灌胃紅三葉異黃酮可提高大鼠血清鈣和磷含量。Atkinson等[4]研究發(fā)現(xiàn)，向49～65歲女性補(bǔ)充異黃酮能增強(qiáng)骨骼密度，降低骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生率。研究表明，植物雌激素可結(jié)合骨組織中的雌激素受體β，抑制破骨細(xì)胞和骨吸收過程，進(jìn)而阻止骨質(zhì)丟失，起到保護(hù)骨密度的作用[19]。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅三葉異黃酮可改善大鼠機(jī)體的鈣磷代謝，在一定程度上可預(yù)防骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

3.5 紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠補(bǔ)充紅三葉異黃酮后，其子宮內(nèi)膜肌層顯著增厚，腺泡數(shù)量顯著增加[20]。李潮等[21]研究表明，大豆黃酮能增加去卵巢大鼠的子宮重量，改善其子宮萎縮情況。另有研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可通過激活圍絕經(jīng)期雌鼠子宮內(nèi)膜雌激素受體β的表達(dá)來發(fā)揮弱雌激素樣作用，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育和內(nèi)膜上皮無纖毛細(xì)胞上的微絨毛生長[22]。與上述結(jié)果相一致，本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜肌層隨著紅三葉異黃酮灌胃劑量的升高得到不同程度地改善，表明紅三葉異黃酮可發(fā)揮其弱雌激素樣作用，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，改善子宮萎縮情況。此外，E2作為緩解更年期女性綜合征的雌激素替代藥物已廣泛的用于激素替代療法中。但E2在刺激子宮內(nèi)膜增生的同時(shí)增加了癌癥的發(fā)生率[13]，因此，選擇植物雌激素作為新型的雌激素替代物已成為當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[23]。本試驗(yàn)中，去卵巢大鼠子宮切片結(jié)果也證明了紅三葉異黃酮具有改善子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能的效果，為植物雌激素進(jìn)一步應(yīng)用于改善動(dòng)物生殖健康提供了一定的依據(jù)。

4 結(jié) 論

① 紅三葉異黃酮可提高去卵巢大鼠的平均日采食量和平均日增重，并提高其飼料利用效率，其中以灌胃100 mg/(kg·d)紅三葉異黃酮為宜。

② 紅三葉異黃酮可改善去卵巢大鼠內(nèi)源激素不平衡的狀況，改善血清鈣和磷含量，并通過影響血清GH和T4含量促進(jìn)大鼠生長。

③ 紅三葉異黃酮可改善去卵巢大鼠子宮內(nèi)膜平滑肌厚度，增加子宮內(nèi)膜腺泡數(shù)量，改善子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。