張晉源 王鈺明 杜中原 董 瑩 李黛淋 王躍麗 黃慶華 杜青之 黃艷玲 趙 峰*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都610041；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室， 北京100193；3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，云浮527400；4.新希望六和股份有限公司，北京100102； 5.唐人神集團(tuán)股份有限公司，株洲412000；6.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島266000； 7.湖南中本智能科技有限公司，長沙410013)

無論是生物學(xué)法或體外消化法評定飼料的有效能值，飼料、糞、尿樣及未消化殘渣的總能(GE)都是必需測定的數(shù)據(jù)，其變異可能直接影響有效能值的準(zhǔn)確性，從而影響不同實驗室測定飼料有效能值的可比性。因此，比較不同實驗室間在樣品GE測定上的差異程度非常重要。目前，在GE的測定上，我國僅有煤的發(fā)熱量測定國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 213—2008)[1]。而動物飼料及糞、尿樣品GE的測定參考國際標(biāo)準(zhǔn)(ISO 9831:1998)[2]，其實驗室間的重復(fù)性變異系數(shù)和再現(xiàn)性變異系數(shù)因樣品不同分別在0.09%～2.10%和0.59%～4.71%變化。Bourdillon等[3-4]的試驗結(jié)果表明，不同實驗室測定飼糧GE的變異系數(shù)因樣品不同在0.29%～1.79%變異。Pérez等[5]也得出不同實驗室測定飼糧GE的變異系數(shù)為1.0%。然而，在上述試驗中，用于測定GE的氧彈熱量計型號未詳細(xì)列出。Sibbald等[6]發(fā)現(xiàn)同一氧彈熱量計在不同的測定模式下GE的測定值存在較大差異。杜中原等[7]的數(shù)據(jù)表明，在同一實驗室條件下不同生產(chǎn)商提供的氧彈熱量計在測定飼料、糞樣的GE及變異程度上均存在明顯的差異。這些客觀存在的變異必將導(dǎo)致不同實驗室間測定GE存在更大的變化，然而，其變異程度鮮見相關(guān)報道。為此，本研究在6個實驗室間使用2種氧彈熱量計測定飼料樣品的GE，從而比較不同實驗室間GE測定的差異及變異程度，為飼糧GE的測定準(zhǔn)確度提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料原料及飼糧

選用玉米、小麥麩、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油為代表性飼料原料樣品，其概略養(yǎng)分見表1。

表1 飼料原料的概略養(yǎng)分(絕干基礎(chǔ))

飼糧1～5由玉米、小麥麩、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、大豆油以及膨潤土中的2～7種原料組成，形成一系列GE梯度相差約0.418 MJ/kg的飼糧；飼糧6～10在飼糧1～5基礎(chǔ)上添加4%的預(yù)混料(維生素和微量元素的添加量參考王亞等[9])等比例替代原飼糧，其組成見表2。除大豆油外，所有樣品粉碎(粉碎機型號：XT-A400；生產(chǎn)商：永康市紅太陽機電)后過40目方形篩孔，于-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 飼糧組成(絕干基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

本試驗分為2個部分。內(nèi)容一：考察飼料的上樣量對氧彈熱量計測定GE值的影響，以確定GE測定值相對穩(wěn)定的適宜上樣量。對6個飼料原料和10個飼糧采用單因素完全隨機設(shè)計，上樣量設(shè)5個處理水平，即0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g，每個處理采用PARR-6400氧彈熱量計重復(fù)測定4次。內(nèi)容二：考察6個實驗室測定飼料原料、飼糧GE的實驗室間變異度及飼料原料間GE的可加性。根據(jù)內(nèi)容一結(jié)果上樣量統(tǒng)一為0.8 g。采用單因素完全隨機設(shè)計，將6個飼料原料和10個飼糧各100 g發(fā)至6個實驗室。其中實驗室1～4采用PARR-6400型氧彈熱量計，實驗室5、6采用IKA C-2000型氧彈熱量計。各實驗室對每個樣品測定4個重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

按GB/T 6435—2014[10]測定樣品的水分含量并計算其干物質(zhì)含量。按GB/T 6432—2018[11]、GB/T 6433—2006[12]、GB/T 6438—2007[13]測定飼料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量。飼料及飼糧的GE的測定根據(jù)ISO 9831:1998[2]的方法進(jìn)行?？紤]到粉狀樣品在燃燒時容易拋灑，從而導(dǎo)致燃燒不充分的幾率增加，因此，采用Whatman鏡頭紙(型號：2105-841)包裹飼料樣品。在測樣前，先稱量10張鏡頭紙的總重量(>0.7 g)，然后在氧彈熱量計中測定鏡頭紙的GE值。測定樣品GE時分別稱量鏡頭紙和樣品的質(zhì)量，在氧彈熱量計的參數(shù)中輸入鏡頭紙的質(zhì)量及每克的能值，以便測定樣品GE時予以扣除。所有實驗室按照相同說明進(jìn)行操作。

預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 1 500 IU，VD3170 IU，VE 11 IU，VK30.5 mg，VB11.0 mg，VB22.5 mg，VB61.0 mg，VB1211 μg，泛酸 pantothenic acid 8.0 mg，煙酸 nicotinic acid 10.0 mg，葉酸 folic acid 0.3 mg，生物素 biotin 0.05 mg，氯化膽堿 choline chloride 350 mg，Cu(as copper sulfate)4.5 mg，F(xiàn)e(as ferrous sulfate)70 mg，Zn(as zinc sulfate)70 mg，Mn(as manganese sulfate)3 mg，Se(as sodium selenite)0.3 mg，I(as calcium iodate)0.14 mg，NaCl 3 g，石粉 limestone 9.1 g，磷酸氫鈣 CaHPO47.8 g，膨潤土 bentonite 18.1 g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

飼糧GE計算值公式如下：

式中：Gk為某組分的GE值(干物質(zhì)基礎(chǔ))；Pk為組分在該飼糧中的比例(干物質(zhì)基礎(chǔ))。

采用SAS 9.2的MEANS模塊計算基本統(tǒng)計量。根據(jù)單因素試驗設(shè)計的原理，用GLM模塊分析上樣量對GE測定值的差異，并采用Contrast語句進(jìn)行GE測定值對上樣量的一次、二次關(guān)系檢驗。根據(jù)GB/T 28043—2019[14]和吳旻[15]的描述計算穩(wěn)健統(tǒng)計Z比分?jǐn)?shù)。根據(jù)GB/T 6379.2—2004[16]的描述計算實驗室間一致性檢驗統(tǒng)計量曼德爾h和k值，并計算GE測定值的重復(fù)性、實驗室間及再現(xiàn)性變異系數(shù)。通過GLM模型分析實驗室間GE測定值的差異顯著性；采用REG模塊將飼糧1～10實測的GE值對計算的GE進(jìn)行線性歸回，采用TEST語句檢驗斜率與1，截距與0的差異顯著性；采用配對TTEST檢驗GE計算值與測定值的差異顯著性。從而檢驗飼料原料間GE測定值在飼糧中是否可加。統(tǒng)計量的計算公式[16]如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣量對飼料樣品GE測定值的影響

由表3可知，6個飼料原料及10個飼糧的GE測定值均隨上樣量的增加而呈顯著線性和二次曲線增加(P<0.05)。0.2 g上樣量樣品的GE測定值均顯著低于0.4～1.0 g上樣量相應(yīng)的GE測定值(P<0.05)。除大豆油和飼糧3以外，0.4 g上樣量測定的樣品GE測定值均顯著低于0.8～1.0 g上樣量相應(yīng)的GE測定值(P<0.05)。在0.6～1.0g上樣量間，樣品GE測定值相對差異較小。

表3 不同樣品的上樣量對GE測定值的影響

2.2 不同實驗室間測定飼料及飼糧GE值的一致性檢驗

由圖1可知，從實驗室GE測定值的Z比分值看，實驗室2有2個樣品的|Z|>3，實驗室5有2個樣品的|Z|>3，實驗室6有1個樣品的|Z|>3。實驗室1、3、4的|Z|均在2以內(nèi)。

實驗室1～4采用PARR-6400型氧彈熱量計，實驗室5～6采用IKA C-2000型氧彈熱量計測定GE。下圖同。

由圖2可知，從實驗室GE測定值一致性檢驗的曼德爾h統(tǒng)計量看，實驗室2的測定結(jié)果偏低，而實驗室5的測定結(jié)果偏高。實驗室4的測定結(jié)果最接近實驗室間的平均值。實驗室1和3的測定結(jié)果與實驗室間的平均值相對接近。從實驗室GE測定值一致性檢驗的曼德爾k統(tǒng)計量看，實驗室5和6的測定結(jié)果變異度接近，且高于實驗室1、2、3、4。實驗室1、2、3、4的變異度相對接近。

圖2 6個實驗室間測定飼料GE的曼德爾h和k統(tǒng)計量

由表4可知，在6個實驗室測定6個飼料原料和10個飼糧GE的多重比較中，實驗室3和5各有12個樣品的GE測定值最高，實驗室2有14個樣品的GE測定值最低，實驗室1有9個樣品的GE測定值偏低。而實驗室4和6的GE測定值最大或最低的樣品數(shù)量少于5個。GE測定值的重復(fù)性變異系數(shù)在0.09%～0.31%，實驗室間變異系數(shù)在0.28%～0.61%，再現(xiàn)性變異系數(shù)在0.29%～0.64%。

表4 不同實驗室測定樣品GE的變異

2.3 不同實驗室間飼糧GE測定值的可加性

由表5可知，實驗室1、3、5和6對10個飼糧GE的計算值與測定值相差分別為-0.05～0.11 MJ/kg、-0.05～0.27 MJ/kg、-0.07～0.20 MJ/kg和-0.12～0.06 MJ/kg，配對t檢驗差異不顯著(P>0.05)。而實驗室2和4對10個飼糧GE的計算值與測定值相差分別為-0.01～0.17 MJ/kg和0.00～0.18 MJ/kg，配對t檢驗差異顯著(P<0.05)。6個實驗室測定10個飼糧的GE測定值對計算值的線性回歸模型中，斜率與1均無顯著差異(P>0.05)，截距與0均無顯著差異(P>0.05)。

表5 不同實驗室飼糧GE測定值與計算值的差異

3 討 論

3.1 上樣量對氧彈熱量計GE測定值的影響

氧彈熱量計測定飼料GE的原理是根據(jù)樣品燃燒后釋放出來的熱量被水吸收，通過測定水溫升高幅度計算樣品的GE值[2]。由于氧彈、點火絲等金屬材料也可以吸收熱量，因此，采用苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定其熱容量。當(dāng)上樣量較低時釋放出來的總熱量低，水溫升高幅度也低，而氧彈、點火絲等金屬材料吸收熱量占比相對較高，從而大大降低了測定的準(zhǔn)確性。ISO 9831—1998[2]規(guī)定上樣量以燃燒后水溫升高2～3 ℃為參考，稱樣重量取決于樣品的能值和氧彈熱量計的有效熱容量，其推薦一般樣品的上樣量為1 g。然而，在實際測定中，樣品(如食糜、體外消化殘渣等)的數(shù)量有時難以達(dá)到規(guī)定的重量要求，或樣品能值及密度偏低，坩堝容量不足以裝載規(guī)定重量的樣品，有些研究者采用添加助燃劑如苯甲酸[17]、礦物油等以使燃燒后溫度升幅達(dá)到儀器規(guī)定的范圍。然而，目前在測定豬、雞、鴨飼糧、糞樣或體外消化水解殘渣的GE值中，鮮見關(guān)于上樣量的詳細(xì)描述[18]，而在實際操作中不同實驗室間在上樣量上可能大相徑庭。本研究中無論是飼料原料還是飼糧，其上樣量在0.2～0.6 g時GE測定值均隨上樣量的增加而升高，而在0.6～1.0 g時GE測定值相對穩(wěn)定，這表明隨著上樣量的增加，水溫升幅增加，氧彈吸收的熱量占比下降，從而使樣品GE測定值趨穩(wěn)。這一現(xiàn)象與馬艷等[19]使用PARR-6300測定玉米的GE在上樣量低于0.5～0.7 g變化時測定值逐步增加并趨穩(wěn)的結(jié)論類似，與杜中原等[7]使用PARR-6400型氧彈熱量計測定玉米GE與上樣量的關(guān)系也相似。上述結(jié)果表明，在飼料樣品GE的測定中，上樣量不應(yīng)低于0.6 g。

3.2 實驗室間氧彈熱量計測定GE值的變異及可加性

目前國內(nèi)飼料企業(yè)測定飼料GE主要采用美國PARR、德國IKA及長沙奔特等不同廠家生產(chǎn)的氧彈熱量計。不同生產(chǎn)商制造的氧彈熱量計在構(gòu)造、GE的計算原理上均存在某些差異。通過苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品校正可以減少不同型號儀器間的差異。在實驗室間測定結(jié)果一致性的統(tǒng)計學(xué)評判上，通過Z比分值考察實驗室間測定的異常值[14-15]，而曼德爾h和k統(tǒng)計量分別表示實驗室間測定值的偏差程度及實驗室內(nèi)的變異程度[16]。根據(jù)|Z|≤2，測定值滿意；2<|Z|<3,測定值“有問題”；|Z|≥3，測定值“不滿意”的評判準(zhǔn)則[15]，本研究中實驗室2有2個樣品測定值“不滿意”；實驗室5有2個樣品GE測定值“不滿意”；實驗室6有1個樣品GE測定值“不滿意”。這些樣品并未呈現(xiàn)特定的某1個或幾個樣品。上述實驗室間96個數(shù)據(jù)比較中，91個數(shù)據(jù)的一致性是滿意，比例達(dá)到94.8%。曼德爾h統(tǒng)計量表明,實驗室2和5的GE測定值偏離了實驗室間的平均測定值。綜合Z比分值和曼德爾h統(tǒng)計量，提示實驗室2、5、6在GE的測定上需要加強測定過程的控制。曼德爾k統(tǒng)計量表明，實驗室5和6測定GE的變異相對偏高，這可能與這2家實驗室采用的氧彈熱量計的型號不同于實驗室1～4有關(guān)，這一現(xiàn)象與杜中原等[7]比較2種型號的氧彈熱量計測定飼料及糞樣GE的變異度存在差異的結(jié)論相似。本研究中16個樣品GE測定的重復(fù)性、實驗室間及再現(xiàn)性變異系數(shù)均在0.64%以內(nèi)。這一變異程度比ISO 9831:1990[2]在剔除部分實驗室異常測定值后7類樣品GE測定值的重復(fù)性變異系數(shù)小于2.10%的范圍??；比Bourdillon等[3-4]報道的不同實驗室測定飼糧GE的變異系數(shù)小于1.79%及Pérez等[5]得出不同實驗室測定飼糧GE的變異系數(shù)為1.0%都低。這表明參與本研究的6個實驗室在測定飼料樣品GE的變異度是相對較低的。

目前在飼料配方中，飼糧的可消化養(yǎng)分的含量都是根據(jù)原料的可消化養(yǎng)分含量線性可加計算的。從方法學(xué)的角度看，可加性是方法成立的基本原則[20-21]。在檢驗?zāi)骋粶y定方法是否具有可加性的手段上，通常采用以下2種統(tǒng)計方法：1)t檢驗比較混合樣品的實測值與根據(jù)混合樣品各成分的實測值及組成比例獲得的計算值是否相等[22-23]；2)根據(jù)混合樣品的測定值對計算值的線性關(guān)系是否與Y=X重疊[24]。本研究中6個實驗室內(nèi)10個飼糧的GE測定值對計算值的回歸與Y=X均重疊，4個實驗室配對t檢驗得出GE測定值與計算值無顯著性差異，但2個實驗室(2和4)GE測定值顯著低于計算值。這表明大多數(shù)實驗室內(nèi)飼料間GE的可加性是非常滿意的。

4 結(jié) 論

氧彈熱量計測定GE的上樣量應(yīng)在0.6 g以上。6個實驗室間測定飼料GE值呈現(xiàn)較好一致性(94.8%的滿意度)，且變異較低(重復(fù)性、再現(xiàn)性及實驗室間的變異系數(shù)≤0.64%)。4個實驗室測定飼料GE的可加性高，2個實驗室的可加性稍低。