劉 華，喬春鳳，陳海燕

1 鄭州頤和醫(yī)院 藥學(xué)部，鄭州 450047；2 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，南寧 530023

芪冬頤心顆粒由黃芪、麥冬、茯苓、人參、地黃、燙龜板、淫羊藿、煅紫石英、桂枝、金銀花、丹參、郁金和炒枳殼等13 味中藥材加工而成，現(xiàn)收載于《中國藥典（2015 年版一部）》，主要用于氣陰兩虛所致的心悸、胸悶、胸痛、氣短乏力、失眠多夢(mèng)、自汗、盜汗、心煩等癥候的治療，亦可用于病毒性心肌炎、冠心病心絞痛見上述癥候的治療[1]。中成藥復(fù)方制劑是多成分的集合體，通過多個(gè)成分間相互協(xié)同作用達(dá)到臨床的治療效果，近年來，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑中。芪冬頤心顆?，F(xiàn)行單成分質(zhì)量控制方法[1]難以全面評(píng)價(jià)其產(chǎn)品質(zhì)量，尚未見對(duì)芪冬頤心顆粒所含成分進(jìn)行定量研究的文獻(xiàn)報(bào)道，因此選取淫羊藿苷為內(nèi)參物，采用高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法對(duì)芪冬頤心顆粒中主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，建立芪冬頤心顆粒多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為全面有效地控制產(chǎn)品整體質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與藥品

Agilent 1290 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

芪冬頤心顆粒（規(guī)格：每袋裝5 g，批號(hào)：190201、190302、190304）來源于沈陽東新藥業(yè)有限公司；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201606，純度：97.6%）和寶藿苷I 對(duì)照品（批號(hào)：111852-201603，純度：99.9%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)：PRF8091225，純度：99.9%）來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；去氫土莫酸對(duì)照品（批號(hào)：CFS201802，含量：98.0%）來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；朝藿定A 對(duì)照品（批號(hào)：18050224，純度：96.5%）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：18052121，純度：98.2%）、茯苓酸對(duì)照品（批號(hào)：18053121，純度：99.5%）均來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品貯備液和混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸對(duì)照品適量，用甲醇制成濃度分別為0.316、0.718、0.454、0.982、0.596、0.118、0.172 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取混合對(duì)照品貯備液2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成濃度分別為15.8、35.9、22.7、49.1、29.8、5.9、8.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液和陰性供試品溶液的制備

取芪冬頤心顆粒適量，混勻研細(xì)，取粉末1.0 g，精密稱定，加入25 mL 甲醇，稱重，超聲提取30 min，放冷后稱重，用甲醇補(bǔ)重后過濾，制成芪冬頤心顆粒供試品溶液。按照《中國藥典（2015 年版一部）》芪冬頤心顆粒“質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”項(xiàng)下的處方工藝，分別制備缺黃芪、缺淫羊藿或缺茯苓的陰性樣品，再按上述方法制備成3 種陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（0～25.0 min檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素）[2]、270 nm（25.0～42.0 min 檢測(cè)朝藿定A、淫羊藿苷和寶藿苷I）[3，4]和210 nm（42.0～60.0 min 檢測(cè)去氫土莫酸和茯苓酸）[5，6]；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～14.0 min，16.0%A；14.0～25.0 min，16.0%A→24.0%A；25.0～42.0 min，24.0%A→45.0%A；42.0～54.0 min，45.0%A →82.0%A；54.0～60.0 min，82.0%A→16.0%A）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下各溶液依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果在供試品溶液色譜圖中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸和茯苓酸峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按各目標(biāo)成分色譜峰計(jì)均≥4000，上述成分的含量測(cè)定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）、芪冬頤心顆粒（B）、黃芪陰性樣品（C）、淫羊藿陰性樣品（D）和茯苓陰性樣品（E）的HPLC 色譜圖譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密吸取 “2.1” 項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用甲醇定容至20 mL，制成線性考察混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，以質(zhì)量濃度（c，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7 種成分的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.6 進(jìn)樣精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得7 種成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 分別為1.02%、0.62%、0.85%、0.59%、0.68%、1.23%、1.11%。

取同一批號(hào)芪冬頤心顆粒適量（批號(hào)：190201），按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定各成分的峰面積，測(cè)得7 種成分含量的RSD 分別為1.65%、1.16%、1.29%、0.97%、1.02%、1.81%、1.78%。

取芪冬頤心顆粒（批號(hào)：190201）的同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、18 h 進(jìn)樣，檢測(cè)7 種成分的峰面積，結(jié)果芪冬頤心顆粒供試品溶液18 h 內(nèi)穩(wěn)定，7 種成分峰面積的RSD 分別為0.99%、0.64%、0.86%、0.57%、0.71%、1.19%、1.08%。

2.7 回收率試驗(yàn)

取7 種成分含量已知的同一批次芪冬頤心顆粒（批號(hào)：190201）適量，除去內(nèi)包裝，混勻研細(xì)，每份0.5g，取9 份，精密稱定，隨機(jī)分成3 組，每組3 份，按《中國藥典（2015 年版四部）》要求，精密加入混合對(duì)照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.113mg·mL-1、芒柄花素0.241mg·mL-1、朝藿定A0.169mg·mL-1、淫羊藿苷0.354mg·mL-1、寶藿苷I0.213mg·mL-1、去氫土莫酸0.041 mg·mL-1、茯苓酸0.059mg·mL-1）1.0、2.0、3.0mL 各一組，使各成分對(duì)照品加入量約為樣品含有量的50%、100%、150%，再按照“2.2”項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算7 種成分的加樣回收率，其平均加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為97.44%（0.93%）、99.60%（0.86%）、99.21%（1.36%）、100.03%（0.75% ）、98.77%（1.08%）、97.64%（1.22%）、96.86%（1.07%）。

2.8 相對(duì)校正因子（RCF）的測(cè)定

依據(jù)“2.5”項(xiàng)下6 種線性關(guān)系（見表1），精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，以淫羊藿苷為內(nèi)參物，按照計(jì)算公式：RCF=fS/fR=

（式中c 代表質(zhì)量濃度，A 代表峰面積，S 代表內(nèi)參物，R代表其他待測(cè)組分）分別計(jì)算6 種成分的RCF，結(jié)果見表2。

表2 6 種成分的相對(duì)校正因子

2.9 RCF 耐用性考察

精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，分別考察高效液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters e2695 型）、色譜柱（Agilent TC-C18柱、Phenomenex C18柱、Waters XTerra MS C18柱）、柱溫（28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）和流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）對(duì)RCF 的影響。結(jié)果顯示在不同儀器、色譜柱條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的平均對(duì)相對(duì)校正因子分別為1.3037、0.9395、1.6854、1.0760、2.0079、1.5491，RSD 分別為0.48%、0.69%、1.03%、0.86%、0.49%、0.67%；不同柱溫條件下，各成分的平均相對(duì)校正因子分別為1.3039、0.9453、1.6918、1.0764、2.0154、1.5515，RSD 分別為0.46%、0.95%、1.19%、1.39%、0.32%、0.63%；不同流速條件下，各成分的平均相對(duì)校正因子分別為1.3019、0.9409、1.6878、1.0726、2.0161、1.5469，RSD 分別為0.35%、0.82%、1.01%、1.34%、0.49%、0.83%。結(jié)果表明，所建立的RCF 耐用性良好。

2.10 待測(cè)組分色譜峰的定位

精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸色譜峰的保留時(shí)間，以內(nèi)參物淫羊藿苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，在不同品牌高效液相色譜儀（Agilent 1290 型、Waters e2695 型）和不同品牌色譜柱（Agilent TC-C18柱、Phenomenex C18柱、Waters XTerra MS C18柱）條件下，采用相對(duì)保留時(shí)間值法對(duì)色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的平均相對(duì)保留時(shí)間分別為0.5118、0.6468、0.9270、1.1335、1.4188、1.5605，RSD分別為1.51%、0.98%、0.69%、0.80%、0.36%、0.83%。

2.11 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)不同批號(hào)的芪冬頤心顆粒，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)批號(hào)平行3 份，依法進(jìn)樣測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷I、去氫土莫酸、茯苓酸的峰面積，采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法分別計(jì)算上述7 種成分的含量。見表3。

表3 7 種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1，n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的篩選

本實(shí)驗(yàn)在芪冬頤心顆粒中測(cè)定目標(biāo)7 種成分的色譜峰的峰形及分離效果，同時(shí)兼顧雜質(zhì)成分的干擾情況，參考相關(guān)文獻(xiàn)，依次對(duì)比考察了乙腈-水[3，4]、乙腈-0.1%磷酸水溶液[5，6]、乙腈-0.1%甲酸水溶液[2]流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)目標(biāo)成分分離效果較好，色譜圖基線較為平穩(wěn)且雜質(zhì)干擾較小，通過對(duì)流動(dòng)相比例不斷摸索優(yōu)化，最終確定采用乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。按照“2.3” 項(xiàng)下流動(dòng)相比例梯度洗脫可用于芪冬頤心顆粒中7 種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

3.2 供試品制備方法的確定

本實(shí)驗(yàn)在芪冬頤心顆粒中測(cè)定目標(biāo)7 種成分綜合提取率，同時(shí)兼顧分析檢測(cè)時(shí)間及雜質(zhì)干擾程度，依次對(duì)比考察了提取溶劑（甲醇[5，6]、稀乙醇[3，4]）和提取方式（超聲提取[5，6]、加熱回流提?。?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇超聲提取效果最佳，還對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行摸索優(yōu)化，最終確定采用甲醇超聲提取30 min 制備芪冬頤心顆粒供試品溶液。在此條件下，7 種成分能夠提取完全，在60 min內(nèi)能夠完成7 種成分的檢測(cè)，雜質(zhì)干擾較小。

4 小 結(jié)

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC-QAMS 法對(duì)芪冬頤心顆粒中7 種成分含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立其多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式。與外標(biāo)法比較，各成分含量測(cè)定結(jié)果無顯著差異（見表3）。本方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，為全面評(píng)價(jià)芪冬頤心顆粒整體內(nèi)在質(zhì)量、提升該顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)，以確保臨床用藥的穩(wěn)定性和治療效果的一致性。