郭方亮，李向芬，邢桂琪，郭林溪，蘇 勤

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 四川大學華西口腔醫(yī)(學)院牙體牙髓病科，成都 610041

馬甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir.）的葉，又名銅錢樹、鐵籬笆，是鼠李科馬甲子屬植物。據(jù)《中藥大辭典》、《中華本草》記載，具有清熱解毒、祛風利濕、消腫止痛、散淤止血和治療癰瘡潰瘍等功效。在其95%乙醇提取物和乙酸乙酯萃取物中，主要活性成分為三萜類、生物堿類（環(huán)肽）以及黃酮類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等活性[1]。余悅等[2]將馬甲子乙酸乙酯提取物用于小鼠潰瘍性結腸炎模型，發(fā)現(xiàn)該提取物能顯著降低血清TNF-α 水平，從而達到良好抗炎的效果，提示中藥馬甲子提取物具有較明顯抗炎作用。臺灣民間偏方中認為，馬甲子可用于治療急性牙痛；但馬甲子能否用于早期牙髓炎癥的控制、促進牙髓組織自愈能力，目前尚無相關研究報道。在牙髓炎癥中，IL-1β、IL-6 和TNFα 是在其病理過程中常見的且極為重要的炎性細胞因子。本研究擬培養(yǎng)炎癥狀態(tài)牙髓細胞，研究馬甲子提取物對體外牙髓細胞的炎癥抑制作用，為其作為牙髓治療的藥材的可行性提供基礎支持，也為其在口腔其他領域中的應用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物

馬甲子乙酸乙酯提取物及乙醇提取物由四川省中醫(yī)藥科學院提供（批號：20170823），植株采自四川省成都市牧馬山，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學院舒光明研究員鑒定確認。

馬甲子乙醇提取物得率為7.43%，馬甲子乙酸乙酯提取物的得率為20.04%。馬甲子提取物溶液配制過程如下：①馬甲子提取物（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）、DMSO 溶液（二甲基亞砜）、細胞培養(yǎng)液，根據(jù)實驗需要的用量，按照250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例分別稱量取出。②在離心管中，將馬甲子提取物與DMSO 溶液按照250 μg∶10 μL 混合，振蕩器振蕩6 min，馬甲子提取物溶解于DMSO 溶液中。③在上步所得溶液中加入按照馬甲子提取物、DMSO 溶液、細胞培養(yǎng)液為250 μg∶10 μL∶1 mL 的比例的細胞培養(yǎng)液，振蕩20 min，使管內(nèi)各組分溶解。④無菌超凈臺下使用細菌微孔濾膜（0.22 μm）過濾所得溶液，即得到無菌的馬甲子提取物的細胞培養(yǎng)液，其濃度為250μg·mL-1，并稀釋為125、62.5μg·mL-1備用，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞株

人牙髓細胞（human dental pulp cells，HDPCs），收集自四川大學華西口腔醫(yī)院外科門診。

1.3 試劑

CCK-8 細胞計數(shù)試劑盒（同仁，日本）；RNA 逆轉錄試劑盒、SYBR qPCR Mix 試劑盒（Takara，日本）；人IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒（R&D，美國）；炎癥細胞炎癥合成引物（Sangon Biotech，上海）；牙齦卟啉單胞菌脂多糖（P.g-LPS，InvivoGen，法國）；細胞培養(yǎng)試劑和消耗材料產(chǎn)自Gibco、Hyclone 和Corning 公司。

1.4 主要儀器

熒光實時定量PCR 儀、超微量核酸蛋白測定儀Scandrop100（Analytikjena，德國）；多功能酶標儀（Thermo，美國）。

1.5 方法

1.5.1 細胞收集與培養(yǎng) 經(jīng)患者知情同意后，取材于本院牙槽外科門診拔除的符合收集牙髓組織標準的年輕第三磨牙，以改良組織塊法培養(yǎng)牙髓原代細胞，經(jīng)流式細胞術的方法鑒定所得細胞為人牙髓細胞[3]。配制含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗溶液的DMEM 培養(yǎng)基，在5%CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 天更換一次培養(yǎng)基,待細胞融合度達80%時，用胰蛋白酶（0.25%）消化法以1∶3 或1∶4 傳代。在倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，判斷細胞狀態(tài)。

1.5.2 形成體外人牙髓細胞炎癥狀態(tài) 取培養(yǎng)所得的P4 或P5 代HDPCs 按1×106個/mL 接種于6 cm 培養(yǎng)皿上，空白對照組為不加入P.g-LPS，實驗組分別為加入1 μg·mL-1P.g-LPS 后刺激HDPCs 3、6、12、24、48h。提取各組樣本總RNA 進行逆轉錄反應，取各組復孔數(shù)為3 進行IL-1β、IL-6、TNF-α 的RT-PCR 實驗，引物序列根據(jù)Genebank 中的IL-1β、IL-6、TNF-α以及GAPDH 基因序列設計，委托上海生工生物工程公司合成，具體序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因序列設計

RT-PCR 反應條件：50℃下2min，95℃下10min；95 ℃下30 sec 與60 ℃下30 sec；共40 循 環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct方法進行分析，通過炎癥相關細胞因子的mRNA 表達水平結果，確定形成炎癥狀態(tài)的體外HDPCs 最佳的P.g-LPS 刺激的時間。

1.5.3 馬甲子提取物對HDPCs 生長的影響 取培養(yǎng)所得的P4 或P5 代HDPCs，按1×106個/mL 接種于96 孔板，空白對照組為正常培養(yǎng)的HDPCs；實驗組為培養(yǎng)所得HDPCs 中分別加入1%DMSO 及250、125、62.5 μg·mL-1馬甲子提取物溶液（組名分別為DMSO 組；250 μg·mL-1乙醇提取物、250 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；125 μg·mL-1乙醇提取物、125 μg·mL-1乙酸乙酯提取物；62.5 μg·mL-1乙醇提取物、62.5 μg·mL-1乙酸乙酯提取物）。各組取復孔數(shù)為3。分別于1、2、3、4、5 d 采用CCK-8 實驗方法獲取各時間點的各組所測得OD 值（A），計算各組細胞活力相對值=（A計算孔-A空白孔）/（A對照第一天-A空白孔），繪制從1 天到5 天的各組HDPCs 的生長曲線，以確定保證HDPCs 生長的最佳的馬甲子提取物濃度。

1.5.4 馬甲子提取物對HDPCs 的炎性因子表達的影響 選取生長狀態(tài)良好的P4 或P5 代的HDPCs，以每孔2×105個的密度接種于6 孔板，空白組（LPS-）：正常培養(yǎng)HDPCs；對照組（LPS+）：加入1μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；溶劑組（DMSO）：加入1%DMSO 與1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs；實驗組（乙醇提取物、乙酸乙酯提取物）：加入125 μg·mL-1馬甲子乙醇或乙酸乙酯提取物，1 μg·mL-1P.g-LPS 的HDPCs。各組復孔數(shù)為3。各組在培養(yǎng)時間結束后分別收集總分泌蛋白，采用ELISA 的實驗方法對各組HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的分泌表達進行檢測；同時完成總RNA 提取、逆轉錄反應、RTPCR 反應，檢測各組HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 表達。

1.6 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0 軟件對結果進行統(tǒng)計學分析，采用ANOVA 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

如圖1 和圖2 所示：通過鏡下觀察，在收集原代細胞后第4～7 天，有細胞從組織塊邊緣爬出，細胞形態(tài)無統(tǒng)一，排列多雜亂無序。經(jīng)培養(yǎng)一段時間至P2 代后，細胞變得均勻一致，多為梭形和多角形，胞質豐富，核位于中央，核仁清晰，形態(tài)似成纖維細胞，可用于后續(xù)實驗。

圖1 原代細胞（40×）

圖2 P2 代細胞（40×）

2.2 P.g-LPS 刺激不同時間HDPCs 的炎癥相關因子mRNA 水平的表達情況

由表2 可見，使用P.g-LPS 刺激HDPCs 3 h，能夠顯著誘導IL-1β，IL-6 及TNF-α 炎癥相關細胞因子基因mRNA 的表達，并且表達水平呈高峰期，即本刺激條件能成功使體外牙髓細胞進入炎癥狀態(tài)，可用于后續(xù)馬甲子提取物抗炎性能的實驗研究。

表2 P.g-LPS 刺激不同時間HDPCs 炎癥相關因子mRNA 表達情況

2.3 不同濃度梯度的馬甲子提取物培養(yǎng)HDPCs的細胞生長曲線

通過測量各分組在各時間點的吸光度，計算各組細胞活力相對值所繪制的各組5 天內(nèi)的HDPCs生長曲線由圖3 可見，1%DMSO 對細胞生長曲線無明顯影響；125 μg·mL-1和62.5 μg·mL-1濃度的馬甲子提取物能保證細胞處于較好的生長增殖狀態(tài)，因此選用濃度相對較高的125 μg·mL-1進行后續(xù)實驗。

圖3 （A）馬甲子乙醇提取物和（B）馬甲子乙酸乙酯提取物不同濃度梯度用于培養(yǎng)HDPCs 的細胞生長曲線（n=5）

2.4 馬甲子提取物對炎癥環(huán)境下HDPCs 的炎性相關細胞因子蛋白及mRNA 表達的影響

由圖4 可見，馬甲子乙醇提取物和馬甲子乙酸乙酯提取物能下調在P.g-LPS 刺激下的HDPCs 的IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 的表達，也能抑制P.g-LPS 刺激下的HDPCs 分泌的IL-1β、IL-6 和TNF-α 蛋白。兩種提取物對炎癥因子mRNA 和蛋白的表達影響無明顯差異。1% DMSO 溶劑對炎癥HDPCs 的相關炎癥細胞因子的表達和分泌無顯著影響。

圖4 炎癥環(huán)境下各組HDPCs 的炎性相關細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白（A、B、C）及mRNA（D、E、F）表達量（n=3）

3 討論

牙髓組織具有一定的自身修復能力，如何消除早期或局限的炎癥牙髓組織中的感染物、保存健康牙髓、維護牙髓正常生理功能是臨床診治該類疾病的首要目的。隨著微創(chuàng)牙科理念的發(fā)展，新材料和新技術的應用，如何精準合理應用各種治療技術和材料，最大限度地獲得損傷牙髓部分活髓保存的良好治療效果，延長患牙保存期，實現(xiàn)保髓治療效果的最大化，已成為口腔臨床醫(yī)生非常關注和迫切需要解決的問題。馬甲子的抗炎性能為其作為活髓保存的抗炎藥物提供一個新的臨床治療思路。

IL-1β、IL-6 和TNF-α 是常見的炎性因子，因此，本實驗中通過檢測其mRNA 和蛋白的表達水平來反映牙髓細胞炎癥的嚴重程度[4-6]。LPS 通過與細胞表面TLR 受體結合后，激活多種下游的與炎癥反應相關的信號通路，因此以LPS 刺激HDPCs 是較為常用形成炎癥狀態(tài)的牙髓細胞的方法[7]。

馬甲子提取物墨綠色粉劑難以直接溶于細胞培養(yǎng)液，為了將馬甲子提取物制備為溶液用于細胞實驗，以DMSO 作為中間溶劑使其與細胞培養(yǎng)液相溶。二甲基亞砜（DMSO）具有良好的熱穩(wěn)定性，能與水及大多數(shù)的有機物相溶，是一種公認的“通用溶劑”，且有研究認為，在4%及更低濃度的DMSO 溶液中，細胞的生長和增殖不受影響[8]。同時，實驗中也通過設置DMSO 的溶劑組消除了DMSO 可能對結果造成的偏倚。

通過實驗檢測了馬甲子提取物對炎癥狀態(tài)的HDPCs 的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA水平和蛋白水平表達的影響，確定馬甲子提取物能顯著抑制其炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達，提示馬甲子提取物能對牙髓炎癥反應產(chǎn)生一定抑制作用。該結果為馬甲子用于口腔臨床相關炎癥的治療提供了一定的基礎支持；但其在牙髓細胞中的抗炎的機理有待進一步的研究。