宋波，曹彥丙，趙東波

西安市人民醫(yī)院（西安市第四醫(yī)院）消化病院，西安710004

胰腺癌是致死率排名第4的惡性腫瘤，惡性程度高，病情進展迅速，確診后5年生存率極低［1］。盡管手術治療、放化療、靶向治療等技術不斷提高，患者預后有所改善，但是治療后復發(fā)率仍然較高。探尋新的與胰腺癌密切相關的生物學標志物有助于提高對胰腺癌的認知，早期診治，改善預后。微小RNA（miRNA）在腫瘤細胞惡性行為中發(fā)揮抑癌或促癌基因作用，現(xiàn)已知多種miRNA參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展［2］。研究表明，miR-338-3p在結直腸癌組織低表達，其基因表達缺失與結直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關［3］；miR-338-3p低表達與卵巢上皮性癌總體生存率和無進展生存率有關［4］。β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶 3（B3GNT3）屬β3GlcNAcT家族成員，是部分癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，可參與胰腺癌免疫抑制和進展［5］。有關miR-338-3p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的報道少見，miR-338-3p與B3GNT3之間是否存在相互作用尚不清楚。本研究觀察miR-338-3p、B3GNT3在胰腺癌組織中的表達變化，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月—2017年12月本院收治的胰腺癌患者92例。納入標準：①均行腹腔鏡胰腺癌切除手術，經(jīng)術后病理檢查確診為胰腺癌；②術前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床資料與病理結果完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，不具備手術指征；③隨訪失聯(lián)。患者男55例，女37例；年齡40～65（60.35 ± 3.21）歲；有慢性胰腺炎病史51例，新發(fā)糖尿?。韧鶡o糖尿病史以相關癥狀，首次經(jīng)臨床診斷糖尿?。?9例；發(fā)病部位：胰頭癌62例、胰體尾部癌30例；病理類型：導管腺癌83例，其他（黏液性囊腺癌5例、泡細胞癌3例、腺磷癌1例）9例；腫瘤直徑≥4 cm 53例，＜4 cm 39例；分化程度：低中分化65例，高分化27例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ期60例；有淋巴結轉(zhuǎn)移27例。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 胰腺癌及癌旁組織miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR。取手術切除的癌組織及其癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm），剪成1 mm3，加入RNA保護液，液氮冷凍保存。TRIzol法提取組織總 RNA，選擇吸光度（A260）/A280為1.9～2.1的RNA樣品，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Epicentre公司）按照試劑盒說明將其轉(zhuǎn)錄為cDNA。用CFX96實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad）。引物合成及序列測定由上?；倒就瓿?，miR-338-3p上游引物序列5'-GGTCCAGCATCAGTGA、下游引物序列5'-GAGCAGGCTGGAGAA3'；B3GNT3上游引物序列5′-GCCGGAGATACTTCATCCTG-3′、下游引物序列5′-GAGAGGAGCAGGTAGAGGGG-3′；β-actin上游引物序列 5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′、下游引物序列5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。反應體系：SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（2×）12.5μL，dNTP 1.6μL，Taq DNA聚合酶1μL，10μmol/L上下游引物各1μL，加反應緩沖液至25μL。反應條件：92℃預變性20 s，96℃變性2 s、85℃延伸20 s、80℃退火6 s共30個循環(huán)。75℃讀取熒光，構建溶解曲線。用 2-ΔΔCt法計算 miR-338-3p、B3GNT3 相對表達量。共做3次平行試驗，取平均值。

1.3 隨訪 患者出院后均定期門診復查，電話或微信隨訪，第1年每3個月隨訪1次，第2年每3～6個月隨訪1次，第3年每6個月隨訪1次，所有患者隨訪3年或至患者死亡。統(tǒng)計隨訪期間胰腺癌患者3年生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，比較采用t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。Pearson相關法分析miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達的相關性。繪制Kaplan-Meier法生存曲線，分析不同miR-338-3p、B3GNT 3 mRNA表達胰腺癌患者的生存率，Log-Rank檢驗比較生存率的差異。Cox回歸分析影響胰腺癌患者生存的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織及癌旁組織中miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達比較 與癌旁組織比較，胰腺癌組織中miR-338-3p表達低，B3GNT3 mRNA表達高（P均＜0.05）。見表1。

表1 胰腺癌組織及癌旁組織中miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達比較（±s）

表1 胰腺癌組織及癌旁組織中miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達比較（±s）

組織胰腺癌組織癌旁組織t P n 92 92 miR-338-3p 0.43±0.16 0.85±0.29 12.163＜0.05 B3GNT3 mRNA 1.35±0.47 0.62±0.30 12.558＜0.05

2.2 胰腺癌組織中miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達的相關性 胰腺癌組織中miR-338-3p表達與B3GNT3 mRNA表達呈負相關（r=-0.571，P＜0.05）。

2.3 miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達與胰腺癌患者臨床病理特征的關系 新發(fā)糖尿病、低中分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者miR-338-3p低于無新發(fā)糖尿病、高分化、TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移患者（P均＜0.05），低中分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉(zhuǎn)移胰腺癌患者B3GNT 3 mRNA表達高于高分化、TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移患者（P均＜0.05）。不同性別、年齡、慢性胰腺炎、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型患者miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學（P均＞0.05）。見表2。

表2 miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達與胰腺癌患者臨床病理特征的關系

2.4 miR-338-3p、B3GNT3 mRNA表達與胰腺癌患者生存的關系 隨訪期間92例胰腺癌患者，死亡 77例，病 死 率 83.70%。根 據(jù) miR-338-3p、B3GNT3 mRNA相對表達量的均值將患者分為miR-338-3p高表達組（miR-338-3p相對表達量≥0.43，45例）、miR-338-3p低表達組（miR-338-3p相對表達量＜0.43，47例），B3GNT3高表達組（B3GNT3 mRNA相對 表 達 量 ≥1.35，49例）、B3GNT3低 表 達 組（B3GNT3 mRNA相對表達量＜1.35，43例）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-338-3p低表達組、miR-338-3p高表達組3年生存率分別為12.77%（6/47）、20.00%（9/45），B3GNT3低表達組、B3GNT3高表達組3年生存率分別為20.93%（9/43）、12.24%（6/49）。miR-338-3p低表達組3年生存率低于miR-338-3p高表達組，B3GNT3低表達組3年生存率高于B3GNT3高表達組（P均＜0.05）。

2.5 胰腺癌患者預后的影響因素 以胰腺癌患者隨訪期間是否死亡（0=否，1=是）為因變量，納入年齡、性別、慢性胰腺炎、合并糖尿病、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、miR-338-3p表達、B3GNT3表達為自變量。多因素COX回歸分析顯示，有淋巴結轉(zhuǎn)移、低表達miR-338-3p、高表達B3GNT3是胰腺癌患者術后3年死亡的危險因素（P均＜0.05），見表3。

表3 胰腺癌患者預后的影響因素多因素COX回歸分析

3 討論

胰腺癌是有高度侵襲性和高致死率的惡性腫瘤，糖尿病家族史、胰腺癌家族史、胰腺炎病史、超重、肥胖、新診斷糖尿病是胰腺癌的高危因素［6］。早期胰腺癌癥狀隱匿，診斷率較低，多數(shù)患者確診時即為晚期，手術切除率低。盡管近年來分子診斷和靶向治療技術不斷完善，但胰腺癌病死率依然很高，預后差。目前缺乏有效的胰腺癌預防、診斷、預后預測的技術手段和生物學標志物，因此胰腺癌分子生物學研究逐漸成為熱點。

miRNA是一類小分子非編碼RNA，可在翻譯后過程中調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、新生血管形成、腫瘤細胞微環(huán)境改變等惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關的病理過程中發(fā)揮重要作用，參與包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等過程［7-8］。miR-338-3p定位于染色體 17q25.3，在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。研究結果顯示，miR-338-3p通過靶向WNT2B促進卵巢癌細胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加細胞對順鉑的敏感性［9］。miR-338-3p通過抑制結腸癌轉(zhuǎn)移相關基因1抑制癌細胞侵襲、遷移，促使癌細胞凋亡，抑制癌癥進展［10］。miR-338-3p通過直接靶向3'-非翻譯區(qū)抑制癌基因-蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B，抑制胃癌細胞遷移，促進胃癌細胞凋亡［11］。miR-338-3p在胰腺癌的表達特點以及作用機制尚不清楚，目前國內(nèi)外鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在胰腺癌組織中表達降低，且其表達與合并糖尿病、胰腺癌分化程度、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移以及預后有關，提示miR-338-3p在胰腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。miR-338-3p表達缺失可能誘導糖尿病發(fā)病，導致其對癌細胞增殖分化、侵襲和遷移調(diào)控機制異常，進而誘導胰腺癌病程進展。NESCA等［12］報道顯示，miR-338-3p可調(diào)控胰島β細胞活性，肥胖和胰島素抵抗可誘導miR-338-3p表達異常，導致β細胞凋亡增加，胰島素分泌下降。糖尿病是胰腺癌的高危因素之一，尤其是新發(fā)糖尿病被認為是胰腺癌的早期表現(xiàn)［13］。由此推測，miR-338-3p可能通過抑制胰島β細胞功能，誘導糖尿病發(fā)病，參與胰腺癌發(fā)病過程。通過隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p表達與胰腺癌患者3年生存率有關，miR-338-3p表達缺失是胰腺癌術后3年死亡的危險因素，提示miR-338-3p可作為胰腺癌預后評估的生物學指標。

B3GNT3是高爾基膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，選擇性表達于胰腺、胃腸道、肝臟、胎盤、腎臟、氣管、中性粒細胞和淋巴細胞中，具有促使N-乙酰氨基乳糖胺鏈合成，生成骨架成分中充當催化劑的二聚唾液酸路易斯A，并參與L-選擇素配體的生物合成及淋巴細胞的歸巢、運輸［14］。B3GNT3參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在神經(jīng)母細胞瘤中，B3GNT3 mRNA表達下調(diào)，B3GNT3過表達可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)母細胞瘤中的黏蛋白型O-糖基化和信號傳導來抑制惡性表型，抑制細胞的遷移、侵襲［15］。但在宮頸癌中，B3GNT3呈過表達，且與FIGO分期、腫瘤大小、腫瘤復發(fā)、淋巴結轉(zhuǎn)移、3年生存率和無進展生存率有關［16］。B3GNT3受miR-149-5p調(diào)控，miR-149-5p通過直接靶向B3GNT3 3'-UTR負調(diào)控B3GNT3 mRNA表達，抑制B3GNT3促使肺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程［17］。本研究結果表明，B3GNT3在胰腺癌過表達，且B3GNT3 mRNA表達與分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及預后有關。提示B3GNT3在胰腺癌中發(fā)揮致癌基因作用，B3GNT3過表達可促使胰腺癌進展。B3GNT3過表達可誘導KRAS和SMAD4基因突變，促使胰腺癌細胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；同時B3GNT3過表達可導致腫瘤浸潤淋巴細胞尤其CD8+T細胞浸潤減少［5］。而KRAS基因與胰腺導管癌高度惡性和較差的預后有關［18］。提示B3GNT3通過調(diào)控KRAS基因表達，誘導腫瘤免疫抑制參與胰腺癌發(fā)病和疾病進展。KONG等［19］發(fā)現(xiàn)，B3GNT3 mRNA表達可促使巨噬細胞浸潤，抑制胰腺癌患者腫瘤免疫力和免疫逃逸，促使癌細胞侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，B3GNT3 mRNA表達與miR-338-3p呈負相關，提示miR-338-3p可能負向調(diào)控B3GNT3 mRNA表達；miR-338-3p低表達可能導致B3GNT3 mRNA表達增高，進而提高其致癌基因作用，促使胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，但miR-338-3p與B3GNT3之間具體作用機制尚不清楚。隨訪結果表明B3GNT3 mRNA表達與胰腺癌患者預后有關，B3GNT3過表達是胰腺癌患者術后3年死亡的危險因素，B3GNT3可為胰腺癌預后評估提供參考。

綜上所述，胰腺癌組織中miR-338-3p低表達，B3GNT3 mRNA高表達。miR-338-3p低表達、B3GNT3過表達均與胰腺癌惡性生物學行為和預后不良有關。推測miR-338-3p可能通過負向調(diào)控B3GNT3參與胰腺癌發(fā)病和進展，兩者有望成為胰腺癌診斷的潛在生物學標志物和治療靶點。