張益霞， 樊 璐， 趙 鑫, 董 川

(1.太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,山西太原 030024；2.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西太原 030006)

癌癥是僅次于心血管疾病的第二大致死疾病[1,2]。前5位癌癥發(fā)病率中肺癌的發(fā)病率和死亡率都位于首位，臨床確診肺癌主要手段是胸部CT和組織病理，但由于檢測設(shè)備分辨率和技術(shù)所限，較難觀察到位置隱蔽的深部癌變組織，且活檢取樣點隨機，易造成腫瘤漏診。因此，急需開發(fā)一種無創(chuàng)、快速、靈敏且能夠在早期預(yù)警和診斷肺癌的方法。癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)是一類廣譜性癌癥標志物，屬于細胞表面糖蛋白家族，分子量為180～200 kDa，于1965年首次在人結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)[3,4]。在健康成人體內(nèi)CEA水平通常為0～5 ng/mL左右，當人體組織出現(xiàn)癌變后，血液中CEA含量開始升高，一般高于20 ng/mL。研究表明不同類型癌癥患者，血液CEA檢測陽性率均達到了顯著水平[5,6]。同時，CEA還可與其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測，作為癌癥診斷依據(jù)，提高對腫瘤的確診正確率[7]。除此之外，血清CEA水平對腫瘤復(fù)發(fā)的敏感性達80%以上，早于臨床和病理檢查[8]。因此，血清CEA水平被臨床用于癌癥患者術(shù)后療效的追蹤?？梢?，血液中的CEA水平可以用于癌癥的預(yù)警、診斷以及療效監(jiān)測。

目前，CEA的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫分析和電化學(xué)方法，靈敏度高，準確性好。然而免疫方法成本高，抗體合成易受環(huán)境因素影響。電化學(xué)傳感器方法存在電極修飾程序復(fù)雜，易受假陽性影響等不足?；跓晒馓键c(CDs)的熒光“開-關(guān)”效應(yīng)，構(gòu)建CEA檢測方法簡便，成本低，無需大型檢測設(shè)備，在熒光探針的構(gòu)建方面表現(xiàn)出巨大潛力。熒光CDs是一種至少在一維空間內(nèi)，尺寸小于10 nm，能穩(wěn)定發(fā)光的納米碳點，是目前最熱門的碳納米材料之一[9]。與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，CDs具有優(yōu)異的生物相容性，化學(xué)及光穩(wěn)定性且綠色環(huán)保性等諸多優(yōu)點[10,11]。本文采用水熱法，制備單分散熒光CDs。利用紫外-可見光譜、熒光光譜、納米粒徑分析和紅外光譜，對所制備的CDs結(jié)構(gòu)形貌、表面電荷、水化半徑、熒光特性、表面基團等特性進行了分析。CDs表面存在π電子云，與適配體(Aptamers，Apts)之間由于π→π* 堆積作用相互吸附，從而猝滅CDs的熒光。當體系中出現(xiàn)CEA時，將適配體競爭性從CDs表面解脫附，體系的熒光得到恢復(fù)。本文基于此原理，構(gòu)建一種熒光“關(guān)-開”探針體系，用于CEA快速分析。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

UV-4802紫外-可見分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司)；Nicolet iS5傅立葉變換紅外光譜儀(美國，賽默飛科技有限公司)；FLS 980-STM穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(愛丁堡儀器有限公司)；NICOMP 380系列納米粒徑與電位分析儀(上海奧法美嘉生物科技有限公司)。

檸檬酸，癌胚抗原(CEA)，聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)，5-ATACCAGCTTATTCAATT-3癌胚抗原適配體(CEA-Apts)，均購于上海生工生物工程公司。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CDs制備與表征依據(jù)文獻方法[12]，以檸檬酸和聚乙烯亞胺為前驅(qū)體，高溫?zé)峤夥ㄖ苽銫Ds。稱取0.2 g檸檬酸和0.36 g PEI于潔凈的燒杯中，加入15 mL超純水，超聲分散30 min。將溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，置于馬弗爐中200 ℃反應(yīng)5 h。取出，室溫下自然冷卻，得到CDs初始溶液，接著將該溶液在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心30 min，收集上清液，過夜透析處理，得到提純后的CDs溶液，4 ℃ 保存，備用。對純化后CDs原溶液進行梯度稀釋，采用紫外-可見分光光度計和熒光光譜儀，在200～800 nm波長范圍內(nèi)，對CDs溶液紫外和熒光特性進行分析。通過檢測熒光強度，獲得最佳CDs濃度。Zeta電位分析儀對CDs的水化粒徑和表面電位進行表征。紅外光譜對CDs表面基團進行分析，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1。

1.2.2 構(gòu)建CDs-Apts熒光“關(guān)-開”探針體系適配體為一條含有18個堿基的DNA單鏈，由于鏈內(nèi)堿基隨機配對，適配體在溶液中出現(xiàn)局部莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不利于其與CDs結(jié)合，進而影響探針體系的檢測靈敏度。實驗將適配體溶液加熱至100 ℃維持10 s，以打開鏈內(nèi)配對堿基，同時添加適量TCIP，阻止鏈內(nèi)S-S的形成，保持適配體的單鏈性。不同濃度適配體與10 μg/mL CDs溶液充分混勻，孵育30 min。對體系的熒光強度進行分析，選擇最佳適配體濃度。在此基礎(chǔ)上，選取3個不同濃度的CDs溶液。將50 μmol/L的適配體分別加入不同濃度的CDs溶液中，充分混勻，得到CDs-Apts溶液，進行紫外-可見和熒光特性分析，選取最佳配比CDs-Apts溶液體系。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs和Apts構(gòu)建熒光“關(guān)-開”探針的機理

CDs的熒光性能穩(wěn)定，其表面具備高密度π電子云，能夠吸收激發(fā)光能量，進而產(chǎn)生電子躍遷，發(fā)射較強熒光，被廣泛用于生物分子的定量檢測[13,14]。適配體加入CDs溶液時，由于π-π堆積作用，適配體被吸附在CDs的表面，從而猝滅了CDs的熒光[15,16]。當待檢測目標CEA加入體系中，由于CEA和適配體之間天然的生物高特異性識別和親和力，這種作用遠大于π-π堆積作用，從而將適配體從CDs表面競爭性解吸附，進而CDs熒光得到恢復(fù)。本文基于熒光“關(guān)-開”效應(yīng)，構(gòu)建CEA探針體系，其原理如圖1所示。

圖1 CDs-Apts“關(guān)-開”體系檢測CEA的原理圖Fig.1 Schematic diagram of CDs-Apts "off-on" system for detecting CEA

2.2 CDs熒光和紫外-可見光譜特性

從圖2(a)可見，CDs熒光光譜為雙峰形式，不隨激發(fā)波長變化而移動的為熒光峰，隨激發(fā)波長變化發(fā)生移動的為倍頻峰，倍頻峰發(fā)射波長是激發(fā)波長的二倍，是由光的散射造成的。本文基于CDs熒光峰(410～485 nm)進行CEA檢測探針體系構(gòu)建。熒光光譜測試結(jié)果顯示隨著激發(fā)波長從200 nm增加到300 nm，CDs熒光先增強后減弱，當激發(fā)光波長為245 nm時，CDs溶液在445 nm處出現(xiàn)最強熒光發(fā)射峰。紫外-可見光譜分析結(jié)果見圖2(b)，CDs溶液在200～230 nm處存在吸收帶，是由于C=C共軛體系的π→π* 躍遷所產(chǎn)生[17]，350 nm處的吸收峰是由于羧基等不飽和體系的n→π*躍遷所產(chǎn)生[18]。同時，圖2(b)內(nèi)插圖顯示CDs溶液在可見光下呈亮黃色，而在紫外光照射下為明亮的藍光，這與445 nm處發(fā)射光譜相一致。

圖2 (a)200～300 nm激發(fā)下CDs溶液熒光光譜:(b)CDs溶液紫外-可見光譜(插圖為可見光和紫外光下CDs溶液照片)Fig.2 (a) Fluorescence spectrum of CDs solution excited by 200-300 nm;(b) UV-Vis spectrum of CDs(The insets shows the pictures of CDs solution under visible and UV light)

2.3 CDs的Zeta電位和FTIR分析

對CDs溶液進行Zeta電位測試和FTIR光譜分析，結(jié)果如圖3所示。Zeta電位分析結(jié)果見圖3(a)，表面電位為-9.96 mV，較窄單峰峰形且呈現(xiàn)正態(tài)分布，表明CDs在溶液中分散性良好。紅外光譜分析結(jié)果如圖3(b)所示。位于1 370～1 460 cm-1的吸收峰是-COO-的特征峰[19]，在1 564 cm-1和1 120 cm-1處的尖峰是由于-NH的彎曲振動和C-NH-C的不對稱伸縮振動[20]，2 810～2 940 cm-1范圍出現(xiàn)的弱吸收峰是由于C-H的伸縮振動，3 274 cm-1是O-H伸縮振動吸收峰[21]。以上結(jié)果表明所制備的CDs表面有-COO-、-NH2、-OH等親水性基團，在溶液中有良好的分散性。

圖3 (a)CDs的Zeta電位；(b)CDs的紅外(IR)光譜Fig.3 (a) Zeta potential;(b) IR spectrum of CDs

2.4 CDs濃度優(yōu)化

為了獲得CDs溶液最佳濃度，實驗通過三個不同濃度CDs溶液(1、5、10 μg/mL)與50 μmol/L適配體共孵育，依據(jù)孵育前后溶液熒光猝滅與恢復(fù)程度作為判斷標準，確立最佳CDs用量。圖4(a)顯示，當CDs濃度為1 μg/mL時，結(jié)合適配體前后CDs溶液在紫外燈照射下，裸眼幾乎辨別不到溶液熒光強度變化。當CDs濃度依次增加到5 μg/mL、10 μg/mL時，觀察到CDs溶液的熒光發(fā)生了明顯猝滅。同時，10 μg/mL CDs溶液與適配體結(jié)合前后，體系的熒光猝滅程度最明顯。進一步利用熒光光譜，分析結(jié)合適配體前后的CDs熒光強度的改變量(圖4(b))，可見當CDs濃度為10 μg/mL時，適配體結(jié)合前后體系熒光強度改變幅度最大，分別是1 μg/mL、5 μg/mL CDs熒光強度變化量的7倍和3倍。因此，本文選取10 μg/mL CDs溶液，用于構(gòu)建CEA熒光“關(guān)-開”探針體系。

圖4 不同濃度CDs(1、5、10 μg/mL)結(jié)合Apts前后：(a)紫外光照射下溶液照片；(b)溶液熒光光譜Fig.4 Different solutions of CDs and CDs-Apts：(a) Pictures of UV irradiation；(b) Fluorescence spectrum

2.5 適配體濃度的優(yōu)化

適配體通過π-π堆積作用與CDs相互結(jié)合，形成CDs-適配體復(fù)合物，導(dǎo)致CDs溶液的熒光被猝滅。當體系中適配體與CDs達到最佳結(jié)合比時，溶液的熒光強度猝滅程度達到最大，有助于提高檢測體系的靈敏度和線性范圍。為了確定體系中CDs與適配體之間最佳比，不同濃度適配體(0～50μmol/L)加入到10 μg/mL 的CDs溶液中，共孵育，如圖5所示。不同比例CDs-適配體混合溶液，在紫外燈照射下隨著適配體濃度增加，可見CDs-適配體溶液熒光強度逐漸減弱，當適配體濃度達到50 μmol/L時，CDs-適配體體系的熒光強度被大幅度猝滅。同時，采用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀，對CDs-適配體體系的熒光強度變化進行定量分析(圖5)。分析結(jié)果證明當適配體濃度為10 μmol/L時，CDs-適配體溶液體系的熒光猝滅程度為25%，而當適配體濃度為50 μmol/L時，CDs-適配體溶液體系的熒光猝滅程度高達90%左右，是10 μmol/L CDs-適配體體系的4～10倍。因此，本實驗選取50 μmol/L的適配體，用于熒光“開-關(guān)”探針體系的構(gòu)建。

圖5 不同濃度適配體的CDs-Apts體系熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of different concentrations of CDs-Apts system

2.6 檢測CEA

將CEA加入到檢測體系中，由于適配體與CEA之間高親和力和特異性結(jié)合，將適配體從CDs表面解離，使得溶液熒光得到恢復(fù)。在最優(yōu)實驗條件下，探針體系對1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL CEA的響應(yīng)，如圖6所示。隨著CEA濃度的增加，CDs-適配體體系的熒光逐漸恢復(fù)(圖6)。445 nm處的熒光強度與CEA濃度的對數(shù)呈現(xiàn)線性相關(guān)性，線性響應(yīng)范圍為1 ng/mL～500 μg/mL。線性方程：F/F0=0.05823×logcCEA+1.25，相關(guān)系數(shù)R2=0.9260，表明線性度良好。本文所構(gòu)建的熒光“關(guān)-開”探針體系，響應(yīng)速度低于25 min。與文獻報道[21 - 23]的其他方法相比，本文構(gòu)建的檢測方法簡便，成本低，耗時短，線性響應(yīng)范圍寬。

圖6 不同濃度CEA條件下CDs探針體系的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of CDs probe system with different concentrations of CEA

2.7 探針體系的特異性和穩(wěn)定性

實驗采用BSA、HAS、AFP作為干擾物質(zhì)，評價探針體系的特異性。結(jié)果表明上述干擾物質(zhì)濃度為10倍CEA濃度時，對CDs-適配體熒光探針體系的熒光強度幾乎沒有影響。而當CEA加入時，體系的熒光強度恢復(fù)到初始值90%以上，證明該體系對CEA具有良好選擇性和抗干擾性，同時說明適配體與CEA之間高特異性和親和力。對同一濃度CEA連續(xù)測量了8次，考察探針體系對CEA檢測的穩(wěn)定性。8次連續(xù)測量的熒光強度回復(fù)程度基本相等，相對標準偏差(RSD)為5.39%，表明CDs-適配體熒光探針體系有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

基于適配體可有效猝滅CDs溶液的熒光，據(jù)此構(gòu)建高靈敏度熒光“關(guān)-開”探針體系，當體系中添加CEA后，CDs的熒光得到恢復(fù)，用于CEA快速檢測，檢測時間小于25 min。該方法具有良好的線性范圍和低的檢測限，對CEA響應(yīng)快，特異性好，且檢測過程簡單易行，成本低，有望用于不同來源樣本中CEA水平監(jiān)測和分析。