李愛民， 范俊楠*， 賀小敏， 楊 登

(1.湖北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，湖北武漢 430072；2.湖北省生態(tài)環(huán)境廳恩施州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，湖北恩施 445000)

硒是地殼中含量比較低的分散元素，其豐度約為0.13 mg/kg。硒是人體必需的微量元素之一，具有增強人體免疫力，提高人體抗癌能力，拮抗鎘、砷、汞等有害重金屬，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成等多種生理功能，缺硒或攝入過量硒都會引發(fā)一系列疾病，對健康造成危害[1,2]。硒在土壤中有多種存在形態(tài)，其中能直接被植物吸收利用的稱為生物有效硒，是植物硒的重要來源，而植物源性含硒食品又是人體硒營養(yǎng)的重要來源[3]。研究發(fā)現(xiàn)，植物含硒量與土壤的含硒量沒有顯著相關性，但與土壤有效硒含量相關性顯著[4,5]。因此，檢測土壤中不同形態(tài)的有效硒含量水平，對研究不同形態(tài)有效硒的生物可利用性具有重要意義。

環(huán)境中有效硒主要包括硒酸根、亞硒酸根和有機硒小分子物質(zhì)，其中有機硒小分子物質(zhì)包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、甲基硒半胱氨酸和硒肽等。由于有效硒含有多種不同化學形態(tài)，因此需要采用不同分離技術與檢測方法聯(lián)用，以達到有效硒形態(tài)的分離檢測，這是目前硒形態(tài)分析的發(fā)展趨勢[6,7]。高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術，雖然具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點，但是儀器價格昂貴，難以推廣。相比較而言，原子熒光光譜法檢測硒元素已有現(xiàn)行的國家和行業(yè)標準，在靈敏度、檢出限等方法性能上與電感耦合等離子質(zhì)譜法基本相當甚至更優(yōu)。本實驗建立了高效液相色譜-原子熒光光譜測定土壤中4種有效的硒形態(tài)，能滿足對硒檢測的實際需求，具有推廣應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀(聚光科技(杭州)股份有限公司)，配SAP-50-LC型形態(tài)分析液相色譜裝置、AFS-9330型原子熒光光度計、Autosampler 5500型自動進樣器；UPR-11-20L型超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；THZ-C型臺式恒溫振蕩器(太倉市華美生化儀器廠)；JA1103N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)。

標準物質(zhì)：硒酸根標準溶液(0.525 μmol/g，以Se計)，亞硒酸根標準溶液(0.543 μmol/g，以Se計)，硒代胱氨酸標準溶液(0.560 μmol/g，以Se計)，硒代蛋氨酸標準溶液(0.499 μmol/g，以Se計)，均購于中國計量科學研究院。HCl、甲酸、氨水、KOH、KI、KBH4、(NH4)2HPO4、KH2PO4均為分析純，購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。實驗用水滿足國家標準(GB/T 6682-2008)一級水要求。

1.2 樣品制備與測試

按照(HJ/T 166-2004)《土壤環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》要求，采集篩選出湖北省恩施州恩施市芭蕉侗族鄉(xiāng)(樣品代號SMP01)、新塘鄉(xiāng)雙河鎮(zhèn)漁塘壩村(樣品代號SMP02)、西河壩種植基地(樣品代號SMP03)、三岔鄉(xiāng)蓮花池村(樣品代號SMP04) 4個不同酸堿度地區(qū)的土壤樣品，自然風干后，研磨、過60目篩，儲存于棕色玻璃瓶中，備用。稱取制備好的土壤樣品1 g(精確到0.001 g)，置于15 mL離心管中，加入10 mL 0.10 mol/L KH2PO4溶液，于恒溫振蕩器上30 ℃、350 r/min振蕩提取120 min，再以3 000 r/min離心15 min后，取上清液過0.45 μm濾膜。濾液按照儀器工作條件測定，以目標化合物保留時間定性，外標法定量。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：Hamoltion PRP-X100 離子交換柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)；流動相為40 mmol/L(NH4)2HPO4溶液(pH=6.0)；洗脫方式為等度洗脫，流速為1.0 mL/min；進樣體積為100 μL。

原子熒光光譜條件：空心陰極燈負高壓為290 V、總電流為90 mA，輔陰極電流為45 mA；載氣流量為400 mL/min；屏蔽氣流量為600 mL/min；原子化器高度為8 mm；原子化器溫度為200 ℃。

2 結果與討論

2.1 提取條件選擇

土壤中有效硒的提取主要是提取水溶態(tài)硒和可交換態(tài)硒。水溶態(tài)硒的提取一般采用去離子水或中性KCl溶液浸提[8,9]；可交換態(tài)硒的提取一般采用KH2PO4溶液、KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液浸提[10]。也有文獻報道其它基質(zhì)中有效硒的提取采用HCl、NaOH溶液等浸提[11,12]。本文直接采用標準(NY/T 3420-2019)《土壤有效硒的測定 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法》中的提取條件，用0.1 mol/L的KH2PO4溶液為提取溶液，不同酸堿度土壤的提取溶液pH值參考表1進行調(diào)節(jié)。

表1 不同酸堿度土壤的提取液pH值

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱和流動相不同形態(tài)有效硒分離常用離子交換色譜柱和C18色譜柱兩種色譜柱。相比而言，離子交換色譜柱對不同形態(tài)硒的分離效果較好[13,14]；采用的流動相有Tris緩沖溶液、(NH4)H2PO4、檸檬酸、甲醇-四丁基溴化銨-(NH4)H2PO4等[15,16]。而(NH4)2HPO4洗脫不同形態(tài)硒的色譜峰形更尖銳[17]。本文比較了Hamoltion PRP-X100柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)和Athena-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)兩種色譜柱，分別以40 mmol/L (NH4)2HPO4、40 mmol/L檸檬酸、40 mmol/L甲酸、2%甲醇+0.5 mmol/L四丁基溴化銨+40 mmol/L(NH4)H2PO4為流動相，對100 μg/L的4種形態(tài)有效硒的分離情況。結果表明：采用Hamoltion PRP-X100離子交換色譜柱，以(NH4)2HPO4為流動相，分離效果更好，實驗結果與文獻報道一致。

2.2.2 流動相濃度選擇本文分別以10、15、25、40、50 mmol/L (NH4)2HPO4溶液為流動相，用20%甲酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，流動相濃度對4種有效硒形態(tài)分離影響見圖1。結果表明：隨著(NH4)2HPO4濃度的增加，硒酸根的保留時間縮短和信號響應值增大明顯；同時磷酸鹽含量增加，容易造成色譜柱壓升高，影響色譜柱使用壽命。40 mmol/L(NH4)2HPO4能在20 min內(nèi)將4種有效硒形態(tài)較好分離。因此(NH4)2HPO4濃度選擇為40 mmol/L。

圖1 流動相濃度對4種有效硒形態(tài)保留時間的影響Fig.1 Effect of mobile phase concentration on the retention time of four available selenium species

2.2.3 流動相pH值選擇不同形態(tài)有效硒在不同的酸堿度的溶液中，以陽離子、陰離子或兩性離子狀態(tài)存在，因此流動相的酸堿度對硒形態(tài)的分離效果影響很大。實驗以40 mmol/L的(NH4)2HPO4溶液為流動相，用20%的甲酸溶液調(diào)節(jié)pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，流動相pH值對4種有效硒形態(tài)分離影響見圖2。結果表明，流動相的pH對各硒形態(tài)保留時間有影響，尤其對硒酸根影響較大，隨著實驗pH值的增加，硒酸根的保留時間縮短明顯；當pH大于6.0時，除了亞硒酸根形態(tài)的有效硒信號響應有減小的趨勢。因此選擇流動相pH值等于6.0。

圖2 流動相pH值對4種有效硒形態(tài)保留時間的影響Fig.2 Effect of pH value of mobile phase on the retention time of four available selenium species

2.3 原子熒光光譜條件優(yōu)化

2.3.1 KBH4濃度選擇考察了KBH4的濃度對硒還原效果影響，結果見圖3。當KBH4的質(zhì)量濃度在10.0～20.0 g/L時，隨著濃度的增加，4種形態(tài)有效硒的熒光強度顯著增大；當KBH4的質(zhì)量濃度大于20.0 g/L時，4種有效硒形態(tài)的熒光強度增幅不大，同時隨著KBH4質(zhì)量濃度的增加，會導致儀器背景噪聲增強。選擇KBH4質(zhì)量濃度為20.0 g/L。

圖3 KBH4濃度對4種有效硒形態(tài)響應的影響Fig.3 Effects of KBH4 concentration on the signal response of four available selenium species

2.3.2 KI濃度選擇考察了KI的濃度對熒光強度的影響，結果見圖4。當KI質(zhì)量濃度在1.0～10.0 g/L時，隨著濃度增加，亞硒酸根和硒酸根的熒光強度增大；硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸熒光強度減?。划擪I質(zhì)量濃度大于10.0 g/L時，4種有效硒形態(tài)的熒光強度變化較小，說明此時硒酸根還原成亞硒酸根的效率已接近最大。選擇KI濃度為10.0 g/L。

圖4 KI濃度對4種有效硒形態(tài)信號響應的影響Fig.4 Effects of KI concentration the signal response of four available selenium species

2.4 校準曲線及檢出限

配制含硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的校準溶液系列，校準系列濃度見表2。將標準系列濃度由低至高的順序按照“1.3”實驗條件測定，以濃度為橫坐標，熒光強度響應峰面積為縱坐標，繪制校準曲線。 4種有效硒形態(tài)的保留時間、校準曲線方程和相關系數(shù)見表3。依據(jù)(HJ 168-2010)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標準制修訂技術導則》，實驗室空白樣品中未檢測出目標物質(zhì)可采用樣品加標，加標濃度為估算檢出限的2～5倍，按照樣品分析的全部步驟測定7次，計算方法檢出限(表3)。

表2 4種有效硒形態(tài)的校準濃度系列(μg/L)

表3 4種有效硒形態(tài)的保留時間、校準曲線及檢出限

2.5 方法精密度和準確度

對樣品SMP01～SMP04添加兩個不同濃度4種硒標準品，硒代胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根添加濃度分別為0.5、0.25、1.0、0.25 mg/kg和2.0、1.0、3.0、1.0 mg/kg，按照建立方法測定，計算6次測定的相對標準偏差(RSD)和加標回收率。實驗結果表明：4種形態(tài)有效硒的實驗室內(nèi)的RSD范圍為1.2%～13.7%，加標回收率范圍為67.6%～94.7%。

2.6 樣品測試

依據(jù)(NY/T 1104-2006)《土壤中全硒的測定》和(NY/T 3420-2019)《土壤有效硒的測定 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法》測定土壤樣品SMP01～SMP04全硒和有效硒，采用“1.3”條件測定土壤樣品SMP01～SMP04中4種有效硒形態(tài)，結果見表4。實驗結果表明：樣品SMP01～SMP04中有效硒含量占全硒含量的13.1%～33.3%；土壤中有效硒存在形態(tài)以硒酸根和亞硒酸根為主，分別占35.1%～46.5%和8.8%～38.2%；硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸未檢出。

表4 土壤樣品中4種有效硒形態(tài)測定結果(mg/kg)

3 結論

建立了高效液相色譜-原子熒光光譜法測定土壤中4種有效硒形態(tài)。方法精密度好、準確度較高，在實際應用上值得推廣。