閆雨潔，董明英，陶加明，杭方學(xué)

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004)

目前，有多種天然或改性蛋白質(zhì)在食品配方中作為乳化劑或乳化穩(wěn)定劑被用于制備納米乳液，其可以充當(dāng)脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的遞送系統(tǒng)，具有有效保護(hù)油的氧化、抑制精油的蒸發(fā)等作用[1-2]。卵白蛋白具有降壓、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫活性等極高的應(yīng)用價(jià)值[3]。但由于自身結(jié)構(gòu)以及在特殊的食品加工條件下會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致OVA的乳化能力較差[4]。因此，研究合適的方法改善OVA的乳化性能有重要意義。

超聲波技術(shù)作為一種操作簡(jiǎn)單、清潔無(wú)污染的處理手段，在食品加工領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛。它不僅可以加快反應(yīng)速度，提高反應(yīng)產(chǎn)率，還可以改善產(chǎn)物的功能特性[5-7]。文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，超聲輔助糖基化反應(yīng)制備賴氨酸-木糖接枝物比傳統(tǒng)濕熱法產(chǎn)物得到了更高濃度的調(diào)味化合物。李素云等[9]研究了超聲和未超聲處理下的小麥蛋白與殼聚糖接枝物，發(fā)現(xiàn)在低超聲功率下制備的接枝物穩(wěn)定性更高。文獻(xiàn)[10]研究了超聲處理獲得的接枝物的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳化性能提高的影響。目前對(duì)超聲輔助糖基化改性產(chǎn)物的功能性質(zhì)研究較多，但在超聲輔助糖基化改性蛋白的乳化體系中，對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響和乳液穩(wěn)定機(jī)理的研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)在超聲波處理下，將卵白蛋白與木糖接枝在一起，并將其制備成乳液?？疾炝巳橐旱募铀贉y(cè)試穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和鹽穩(wěn)定性，并將其與傳統(tǒng)濕熱法進(jìn)行了比較，揭示了通過(guò)超聲波改變構(gòu)象的蛋白質(zhì)與糖形成接枝物對(duì)乳液性能的影響。該研究將為以O(shè)VA為原料在食品配方中作為乳化劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

卵清蛋白(OVA，A5253，分子量為45 kDa)：Sigma公司；木糖(Xyl,分子量為150.13 Da)、鄰苯二甲醛、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇：分析純，麥克林化學(xué)試劑有限公司；大豆油：益海嘉里食品科技有限公司。

1.2 主要儀器

Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Cenlee 18R冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；IRTracer-100傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司；Ultra-Turra T18高速剪切分散器 德國(guó)IKA公司；Malvern Nano ZS90激光粒度分析儀 英國(guó)Malvern公司；Olympus CKX41顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波輔助卵白蛋白糖基化產(chǎn)物的制備

超聲處理是通過(guò)超聲波細(xì)胞破碎儀將超聲探頭直接浸入溶液中進(jìn)行的，超聲處理?xiàng)l件設(shè)置為500 W時(shí)具有脈沖模式(3 s打開和2 s關(guān)閉)。超聲波輔助卵白蛋白糖基化產(chǎn)物的制備是將OVA與木糖按照質(zhì)量比為1∶3溶于0.1 mol/L，pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，配制濃度為80 mg/mL的溶液，攪拌直至完全溶解?；旌衔镌?5 ℃水浴中加熱120 min，其中包括在反應(yīng)的初期持續(xù)20 min，將OVA與木糖的混合溶液進(jìn)行超聲輔助水浴加熱，然后進(jìn)行水浴加熱(非超聲處理)，可累積100 min。反應(yīng)完成后，將溶液放置在冰水浴中直至溫度降低到室溫。最后將接枝物冷凍干燥并保存在4 ℃下以便進(jìn)一步分析。此外，接枝物也采用傳統(tǒng)濕熱法制備。

1.3.2 糖基化程度(DG)的測(cè)定

采用過(guò)鄰苯二甲醛(OPA)法測(cè)定蛋白質(zhì)的游離氨基含量，進(jìn)而來(lái)計(jì)算DG。準(zhǔn)確稱取40 mg鄰苯二甲醛溶解于1 mL的甲醇中，分別加入20% (W/V)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.5 mL、0.1 mol/L的硼砂25 mL和100 μL β-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50 mL，此為OPA試劑，OPA試劑應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。測(cè)定時(shí)取OPA試劑4 mL于試管中，分別注入200 μL適當(dāng)稀釋的樣品液，混勻后于35 ℃反應(yīng)2 min，然后在340 nm下測(cè)得樣品吸光值。以在OPA 試劑中加入200 μL蒸餾水作為空白樣，賴氨酸用作計(jì)算游離氨基含量的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)下式計(jì)算原始OVA 和接枝物的DG：

DG/%=(C0-Ct)/C0×100。

式中：C0和Ct分別為原始OVA 和接枝物的游離氨基含量。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

通過(guò)FTIR分析接枝物的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。在測(cè)量之前，將樣品與經(jīng)高溫烘干的溴化鉀混合并壓成薄片，使用FTIR光譜在500～4000 cm-1波段進(jìn)行掃描獲取光譜。

1.3.4 乳液活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的測(cè)定

乳液活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)的測(cè)定根據(jù)比濁法稍作修改。將5 mL接枝物溶液和10 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0，0.01 mol/L)混合并水合15 min。將5 mL大豆油添加到混合物中，并通過(guò)高速剪切分散器在10000 r/min均質(zhì)2 min,然后立即用移液器從容器底部吸取50 μL的乳液添加到5.0 mL 0.1% SDS中，測(cè)量其在500 nm處的吸光度值，EAI和ESI按下式計(jì)算:

式中：A0和A10是0 min和10 min時(shí)在500 nm處測(cè)量的吸光度；N是稀釋因子(100)；C是蛋白質(zhì)濃度，g/mL；φ是油體積分?jǐn)?shù)(0.25)；L是比色皿的路徑長(zhǎng)度(1 cm)。

1.3.5 乳液制備

將濃度為1%(W/V)的接枝物溶液和5%(V/V)的大豆油混合，并使用高速剪切分散器以10000 r/min將混合物預(yù)乳化2 min，制成粗乳液。之后使用超聲波細(xì)胞破碎儀將混合物處理15 min。超聲處理?xiàng)l件設(shè)置為400 W，具有脈沖模式(脈沖持續(xù)時(shí)間設(shè)置為2 s打開和2 s關(guān)閉)。乳化過(guò)程使用冰水浴，以避免溫度過(guò)高。

1.3.6 液滴尺寸測(cè)量

乳液制備后直接測(cè)定乳液樣品的粒徑。使用激光粒度分析儀在25 ℃下測(cè)量乳液的平均液滴尺寸。在測(cè)量之前，將樣品稀釋100倍，以避免多重散射效應(yīng)。

1.3.7 乳液微結(jié)構(gòu)

使用顯微鏡的10倍放大倍率研究乳液的微觀結(jié)構(gòu)。將一小滴乳液滴在顯微鏡載玻片上，并蓋上蓋玻片觀察。

1.3.8 加速測(cè)試的穩(wěn)定性分析

使用高溫下的加速試驗(yàn)評(píng)估乳液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。將制備好的乳液密封在10 mL透明的旋蓋小瓶中，以最大程度地減少蒸發(fā)，然后將乳液儲(chǔ)存在設(shè)定為60 ℃的烘箱中。在不同的儲(chǔ)存時(shí)間，即0，3，5，7 d，將乳液取出進(jìn)行粒度測(cè)量。

1.3.9 凍融穩(wěn)定性分析

將制備好的乳液密封在10 mL透明的旋蓋小瓶中，立即將其放入溫度為-18 ℃的冰箱中24 h。冷凍后將樣品置于25 ℃的水浴中融化2 h以解凍。重復(fù)此凍融程序2次，并在每個(gè)循環(huán)后對(duì)乳液進(jìn)行粒度測(cè)量和顯微鏡觀察。

1.3.10 對(duì)高溫和高鹽濃度的穩(wěn)定性分析

為了研究乳液的耐鹽和耐溫性，制備NaCl濃度為0.2 mol/L的乳液，并在90 ℃的水浴中處理30 min，然后將樣品置于冰水中將其冷卻至室溫，將乳液取出進(jìn)行粒度測(cè)量和顯微鏡觀察。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯多重范圍檢驗(yàn)(Duncan＇s)來(lái)評(píng)估顯著性差異(p<0.05)，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接枝度(DG)分析

樣品的接枝度(DG)通常被用來(lái)作為反映美拉德反應(yīng)進(jìn)程的指標(biāo)。DG的增加代表著游離氨基的減少。OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的DG值見(jiàn)表1。

表1 OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的DG值Table 1 DG values of OVA,OVA-X conjugates and uOVA-X conjugates

由表1可知，糖基化反應(yīng)后，OVA-X的接枝度為18.19%，表明在加熱過(guò)程中OVA與糖之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)。蛋白質(zhì)的游離氨基與糖的還原端羰基之間的縮合反應(yīng)可降低蛋白質(zhì)中游離氨基的含量[11]。DG表明糖成功地與OVA結(jié)合。而超聲處理后，接枝度增加為22.09%，表明超聲處理可以加快OVA與木糖之間的接枝反應(yīng)。這是因?yàn)樵诔曁幚磉^(guò)程中，超聲空化過(guò)程中能夠?yàn)榻又Ψ磻?yīng)提供更多能量[12]，這導(dǎo)致分子快速運(yùn)動(dòng)，從而使反應(yīng)基團(tuán)更接近，加速蛋白質(zhì)和糖之間的糖基化。此外，超聲處理可能破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的游離氨基逐漸暴露于分子表面參與接枝反應(yīng)[13]。

2.2 FTIR分析

蛋白質(zhì)與糖發(fā)生反應(yīng)，F(xiàn)TIR光譜中會(huì)出現(xiàn)新的譜帶，或者譜帶的吸收強(qiáng)度或位置會(huì)發(fā)生變化，可以用來(lái)分析蛋白質(zhì)-碳水化合物系統(tǒng)。OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的FTIR光譜見(jiàn)圖1。

圖1 OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of OVA,OVA-X conjugates and uOVA-X conjugates

由圖1可知，與OVA相比，接枝物OVA-X、uOVA-X的峰值在3600～3000 cm-1變寬，并且吸收峰從3302 cm-1移至更高的吸收強(qiáng)度，這些變化是由于游離和鍵合的羥基和氨基基團(tuán)能夠與蛋白質(zhì)中肽鍵的羰基形成氫鍵[14]。OVA的酰胺II和酰胺III的譜帶分別在1543，1238 cm-1處觀察到，接枝物OVA-X、uOVA-X的吸收峰均移至更高波數(shù)，同時(shí)酰胺I、酰胺II譜帶的吸收強(qiáng)度降低，這歸因于在美拉德反應(yīng)期間消耗了部分氨基，以上結(jié)果表明OVA和糖發(fā)生了接枝反應(yīng)，改變了OVA的結(jié)構(gòu)[15]。與OVA-X相比，uOVA-X紅外光譜的吸收峰位置和強(qiáng)度發(fā)生了細(xì)微變化，但紅外光譜顯示出相似的特征。

2.3 超聲改性接枝物的乳化性能

OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性見(jiàn)圖2。

圖2 OVA、OVA-X接枝物和uOVA-X接枝物的乳化活性(EAI)與乳化穩(wěn)定性(ESI)Fig.2 Emulsification activity (EAI)and emulsification stability (ESI)of OVA,OVA-X conjugates and uOVA-X conjugates注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

由圖2可知，OVA-糖接枝物的EAI和ESI均優(yōu)于OVA。這是因?yàn)榻又ξ锔邇捎H性，能夠迅速擴(kuò)散，吸附到油滴表面，形成大分子穩(wěn)定層，增強(qiáng)乳狀液滴表面的空間排斥，從而阻止油滴的絮凝和聚集[16]。通過(guò)超聲處理獲得的OVA-糖接枝物的EAI和ESI比OVA-X顯著提高(P<0.05)，這與DG值一致。這些結(jié)果表明，超聲處理下的OVA糖基化反應(yīng)可能是提高OVA 乳化性能的更有效方法。其EAI和ESI的改善可以從兩個(gè)方面進(jìn)行解釋；一方面歸因于通過(guò)超聲處理，其蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)更易與糖中的還原端羰基反應(yīng)，從而達(dá)到新的疏水-親水平衡，這有利于乳液的形成和穩(wěn)定。另一方面，超聲處理可能會(huì)由于與空化有關(guān)的效應(yīng)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水中進(jìn)一步延伸，分子結(jié)構(gòu)的形態(tài)從緊密的球形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮ⅲ┞冻鰞?nèi)部疏水基團(tuán)。這些作用是通過(guò)暫時(shí)分散聚集體和破壞聚合物鏈中的共價(jià)鍵而引起大分子解聚，從而增加蛋白質(zhì)分子的遷移率，更有利于其在油-水界面上的吸附和展開[17]。

2.4 加速測(cè)試對(duì)超聲改性接枝物的乳液穩(wěn)定性的影響

在食品工業(yè)中，乳液需要具有一定的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。因此，需要了解乳液在儲(chǔ)存過(guò)程中的物理穩(wěn)定性。故通過(guò)在60 ℃下的加速試驗(yàn)評(píng)估天然OVA、OVA-X和uOVA-X制備乳液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。乳液在60 ℃加速測(cè)試時(shí)的平均粒徑見(jiàn)圖3。

圖3 乳液在60 ℃加速測(cè)試時(shí)的平均粒徑Fig.3 The average particle size of emulsion at 60 ℃ acceleration test

由圖3可知，乳液OVA-X的平均粒徑增大。這是因?yàn)槟咎堑囊朐黾恿巳橐旱钠骄?。此外，在超聲處理下乳?uOVA-X的平均粒徑隨之減小。這可能是由于超聲空化作用引起的強(qiáng)烈剪切力使乳液液滴破裂，變得更小。這有助于接枝物在水油界面的遷移和在油滴表面的吸收率，從而阻止了液滴重力分離和聚集。對(duì)于在儲(chǔ)存過(guò)程中乳液液滴尺寸的變化，天然OVA在儲(chǔ)存7 d后顯著增加(p<0.05)，這表明OVA制備的乳液穩(wěn)定性較差。由OVA-X制備的乳液在儲(chǔ)存期的第5天和第7天觀察到乳液平均粒徑變化不明顯。相比之下，對(duì)于uOVA-X制備的乳液，乳液平均粒徑在第5天和第7天的變化幾乎可以忽略不計(jì)。結(jié)果表明，接枝物能夠提供足夠的乳液穩(wěn)定性來(lái)對(duì)抗加速試驗(yàn)，而增加超聲處理更有利于乳液穩(wěn)定性的提升。這是因?yàn)樵谔腔磻?yīng)后，接枝物可以比天然蛋白在油滴周圍形成一個(gè)更厚的彈性粘膜并產(chǎn)生位阻，從而可以增強(qiáng)油滴之間的排斥性空間力，保護(hù)相鄰液滴免于絮凝和聚集[18]。而在超聲處理下，會(huì)導(dǎo)致更多蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露，使其達(dá)到新的疏水-親水平衡，有利于乳液的穩(wěn)定，從而增強(qiáng)了抗加速穩(wěn)定性。

2.5 連續(xù)凍融對(duì)超聲改性接枝物的乳液穩(wěn)定性的影響

近年來(lái)，對(duì)于類似蛋黃醬這一類冷凍儲(chǔ)存后在使用前解凍的乳液，其潛在的應(yīng)用正在增加。然而大多數(shù)用天然蛋白制備的乳液在冷凍和融化后變得不穩(wěn)定，甚至完全分解成油相和水相，限制了OVA在冷凍食品中的利用。因此，提高OVA乳液的凍融穩(wěn)定性具有重要意義。循環(huán)凍融前后乳液的平均粒徑見(jiàn)圖4。

圖4 循環(huán)凍融前后乳液的平均粒徑Fig.4 The average particle size of emulsion before and after freeze-thaw cycles

由圖4可知，在凍融發(fā)生后，OVA制備的乳液的平均粒徑變化較大，而OVA-X和uOVA-X制備的乳液的平均粒徑變化較小，表明其對(duì)冷凍具有很大的耐受性。同時(shí)，在圖5中顯示了用OVA、OVA-X和uOVA-X制備的乳液的顯微鏡圖像，當(dāng)?shù)谝淮蝺鋈诎l(fā)生后，由OVA制備的乳液具有許多明顯的多分散性大油滴和不規(guī)則形狀的聚集體。這是因?yàn)镺VA制備的乳液的空間位阻不足以抵抗油滴之間的聚集，油滴之間的排斥力降低，OVA乳液的油滴發(fā)生絮凝。而OVA-X和uOVA-X制備的乳液的顯微鏡圖像幾乎沒(méi)有變化，仍表現(xiàn)出內(nèi)部密集且均勻分布的小油滴。凍融循環(huán)后，OVA制備的乳液液滴發(fā)生了更嚴(yán)重的絮凝和聚結(jié)，同時(shí)生成了更大的油滴，這主要?dú)w因于冷凍過(guò)程中冰晶的形成可以穿透被吸附的蛋白質(zhì)層，從而促進(jìn)油滴的絮凝[19]。另外，低溫條件可能改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而可能導(dǎo)致膜層保護(hù)功能喪失[20]。而OVA-X制備的乳液在第二次凍融發(fā)生后似乎比OVA保持了更好的穩(wěn)定性，因?yàn)槌顺霈F(xiàn)多分散性的大液滴，乳液的絮凝和聚結(jié)并不明顯。由uOVA-X制備的乳液的顯微鏡圖像幾乎沒(méi)有變化。OVA-X制備的乳液在油滴表面上形成較厚的界面層，使冷凍時(shí)形成的晶體難以滲透并破壞油滴周圍的界面膜，從而防止了凍融循環(huán)后的聚結(jié)。而通過(guò)超聲制備的乳液可能由于其具有較高凈電荷的液滴，產(chǎn)生更強(qiáng)的靜電排斥力以減少聚集[21]。

圖5 乳液2次凍融循環(huán)前后的微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 The microstructure of emulsion before and after two freeze-thaw cycles

2.6 高溫和高鹽對(duì)超聲改性接枝物的乳液穩(wěn)定性的影響

食品工業(yè)中通常采用熱處理技術(shù)來(lái)防止食品變質(zhì)。之前有研究表明，由蛋白質(zhì)制備的水包油乳液，本質(zhì)上是熱力學(xué)不穩(wěn)定的遞送系統(tǒng)，對(duì)高溫和高鹽濃度敏感，乳液體系易發(fā)生聚集、絮凝和相分離。這是由于高溫和高鹽濃度會(huì)導(dǎo)致OVA變性，從而導(dǎo)致疏水性氨基酸和二硫鍵基團(tuán)暴露，通過(guò)疏水性相互作用和二硫鍵促進(jìn)進(jìn)一步的絮凝[22]。因此，有必要了解乳液在高溫和高鹽濃度情況下的物理穩(wěn)定性。加熱前后乳液的平均粒徑見(jiàn)圖6。

由圖6可知，加熱30 min后，OVA制備的乳液的平均粒徑較OVA-X制備的乳液顯著增大，而uOVA-X制備的乳液的平均粒徑幾乎沒(méi)有變化。超聲處理進(jìn)一步增加了乳液的耐高溫和高鹽濃度的穩(wěn)定性。顯微鏡圖像進(jìn)一步支持了OVA、OVA-X和uOVA-X三者制備的乳液穩(wěn)定性的差異，見(jiàn)圖7。

圖6 加熱前后乳液的平均粒徑Fig.6 The average particle size of emulsion before and after thermal treatment

圖7 乳液加熱前后的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 The microstructure of emulsion before and after thermal treatment

由圖7可知用OVA、OVA-X和uOVA-X制備的乳液的顯微鏡圖像，當(dāng)鹽濃度為0.2 mol/L，在90 ℃條件下加熱30 min時(shí)，由OVA制備的乳液油滴發(fā)生了絮凝和聚結(jié)。而OVA-X和uOVA-X制備的乳液的顯微鏡圖像幾乎沒(méi)有變化，仍表現(xiàn)出內(nèi)部密集且均勻分布的小液滴。結(jié)果表明，糖基化反應(yīng)對(duì)高鹽高熱誘導(dǎo)聚集具有抑制作用。這是因?yàn)樘腔磻?yīng)增加了空間位阻，從而降低了液滴之間的吸引力。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乳液為高溫高鹽體系，相對(duì)于天然OVA，OVA-X和uOVA-X制備的乳液表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，這為OVA-X和uOVA-X在食品工業(yè)中作為乳化劑進(jìn)行熱巴氏滅菌提供了可能性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)OVA、OVA-X、uOVA-X制備的乳液穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。經(jīng)超聲處理的糖基化改性蛋白乳液具有更小的液滴尺寸以及更好的加速測(cè)試穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和耐高溫高鹽穩(wěn)定性。初步明確了適當(dāng)?shù)某曁幚砜梢詫?dǎo)致OVA的空間構(gòu)象和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，這有利于乳液穩(wěn)定。此外，超聲處理通過(guò)暫時(shí)分散聚集體等行為阻止了乳液在不良條件下油滴的重力分離和聚集。因此，通過(guò)超聲波輔助糖基化反應(yīng)提高OVA乳化性能是可行的，這為擴(kuò)大OVA在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了有用的信息。