王涵，劉衛(wèi)平，龍乾發(fā)，李俊辰，黑悅，劉宇琪，季丞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種隱匿起病的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，目前機(jī)制尚不清楚；雖然在AD的研究方面已投入巨大，但仍然缺乏有效的預(yù)防及治療措施[1-2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管生成、清除病理蛋白以及基質(zhì)重構(gòu)等功能[3]。而間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-EXO)不僅具有與間充質(zhì)干細(xì)胞相似的功能，并且具有更好的安全性[4]。本研究以APP/PS1小鼠作為AD的疾病模型，給予尾靜脈注射MSC-EXO處理，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的沉積，并通過(guò)Nissl染色觀察海馬組織的神經(jīng)元數(shù)量；并對(duì)NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)及血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；以探討MSC-EXO對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制，為AD的治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)APP/PS1雄性小鼠以及年齡匹配的野生型C57BL/6小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006)，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2019-001；小鼠在12∶12白晝交替的環(huán)境中自由飲食飲水。本研究方案得到空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基(友康恒業(yè)生物科技有限公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma，D9542-10MG)；兔抗ACTB(Abclonal，AC026)；兔抗Nrf2(Abmart，T55136S)；兔抗keap1(Proteintech，10503-2-AP)；兔抗HO-1(Proteintech，10701-1-AP)；6e10抗體(Biolegend，SIG-39320)；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠(Thermo Fisher Scientific，A16078)，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔(Thermo Fisher Scientific，A16096)，CD9單克隆抗體(Abcam，ab92726)；TSG101單克隆抗體(Abcam，ab125011)；Alexa FlourTM 594 C5 Maleimide(Invitrogen，A10256)。

1.2 方法

1.2.1 MSC培養(yǎng)及外泌體(exosome,EXO)分離、鑒定 本課題組前期已形成成熟的MSC培養(yǎng)和EXO分離與鑒定的方法[5]。使用干細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞融合至80%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，收集細(xì)胞上清，于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，或者直接進(jìn)行EXO的分離。采用超速離心法在4 ℃下進(jìn)行EXO的分離，依次300 g/min離心10 min、2 000 g/min離心10 min、10 000 g/min離心20 min去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，100 000 g/min離心70 min得沉淀，PBS重懸；再次100 000 g/min離心70 min，沉淀以100 μL PBS重懸，-80 ℃保存。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)EXO的表面標(biāo)志物CD9和TSG101，電子顯微鏡(電鏡)觀察EXO的形態(tài)。

1.2.2 EXO的標(biāo)記與示蹤 按本課題組前期研究的方法[6]。將Alexa FlourTM594 C5 Maleimide加入EXO懸液中，避光常溫孵育1 h；EXO旋轉(zhuǎn)柱(MW3000,Invitrogen)中的樹(shù)脂粉末在常溫下水化15～30 min，離心去除多余的水分，將旋轉(zhuǎn)柱放入1.5 mL離心管中，孵育完畢的EXO加入樹(shù)脂中，750 g離心5 min，收集標(biāo)記的MSC-EXO。將標(biāo)記的MSC-EXO通過(guò)尾靜脈注射入APP/PS1小鼠體內(nèi)，24 h后麻醉小鼠，灌注取腦固定，行免疫熒光染色，用共聚焦顯微鏡對(duì)小鼠大腦切片進(jìn)行觀察拍照。

1.2.3 動(dòng)物分組及處理 將20只培養(yǎng)至9個(gè)月大的APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組(AD+saline)和治療組(AD+EXO)，每組10只；將年齡匹配的10只野生型c57小鼠作為正常對(duì)照組。治療組小鼠通過(guò)尾靜脈注射50 μg/150 μL EXO懸液，AD+ saline組和對(duì)照組小鼠注射等體積的生理鹽水。30 d后，每組4只小鼠直接取海馬組織做免疫印跡實(shí)驗(yàn)，每組3只小鼠4%多聚甲醛灌注后取海馬行免疫組化染色，每組3只小鼠取海馬用4%戊二醛固定后電鏡下觀察。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法 3組小鼠在注射EXO或生理鹽水后30 d處死，于冰上快速剝離海馬組織，加入RIPA裂解液，超聲裂解后，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行BCA定量，然后加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，制備蛋白樣品。10%瓊脂糖凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST緩沖液洗膜，4 ℃下一抗孵育過(guò)夜；次日復(fù)溫1 h，TBST洗膜，常溫下二抗孵育2 h，加入發(fā)光液于發(fā)光儀中曝光。用Image Lab分析條帶。

1.2.5 免疫組化和免疫熒光染色 小鼠麻醉后用4%多聚甲醛灌注，剝離腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片(厚度4～10 μm)。將切片依次浸入二甲苯及梯度乙醇中進(jìn)行脫蠟和水化；之后放入枸櫞酸緩沖液中沸水浴100 s進(jìn)行抗原修復(fù)；在3%的過(guò)氧化氫溶液中室溫孵育30 min，TBS沖洗3次；二抗來(lái)源的血清室溫下封閉1 h，加一抗在濕盒中孵育過(guò)夜；次日用TBS沖洗切片，室溫下孵育二抗2 h(免疫組化用HRP偶聯(lián)的二抗，免疫熒光用Alex 488偶聯(lián)的二抗)。免疫組化染色：二抗洗滌后，DAB顯色，自來(lái)水終止；蘇木素復(fù)染30～60 s，水洗后用1%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水返藍(lán)，脫水固定封片。免疫熒光染色：二抗洗滌后，DAPI染色10 min，洗滌后，封片。在顯微鏡下觀察切片，并采集圖像。

1.2.6 透射電鏡觀察 取腦剝離海馬組織，浸泡在4%戊二醛固定液中將海馬切成組織塊(1 mm×1 mm×2 mm)，繼續(xù)在4%戊二醛溶液中固定24 h，PBS緩沖液沖洗；1%鋨酸中后固定，漂洗；梯度乙醇及丙酮脫水；依次使用不同比例的丙酮與包埋劑進(jìn)行滲透；使用812樹(shù)脂進(jìn)行包埋，將包埋板放入恒溫干燥箱中37 ℃ 4 h、45 ℃ 6 h、60 ℃ 12 h依次干燥后，進(jìn)行超薄切片，片厚50～100 nm；醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別染色30 min、10 min，蒸餾水漂洗，干燥，電鏡下觀察。

1.2.7 尼氏染色(Nissl staining) 取材及石蠟包埋、切片等步驟同上。石蠟切片依次在二甲苯和梯度乙醇中脫蠟和水化，用1%焦油紫溶液染色20 min，蒸餾水清洗切片，用70%乙醇分色，之后梯度乙醇脫水，固定封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞及EXO鑒定、示蹤 流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)干細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD90、CD44，陽(yáng)性率均在90%以上，低表達(dá)造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45，陽(yáng)性率均低于2%(圖1)。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，EXO表面標(biāo)志蛋白TSG101、CD9呈陽(yáng)性；電鏡觀察MSC-EXO為類圓形雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，呈盤狀或茶托狀，膜結(jié)構(gòu)完整，直徑在30～150 nm之間，具有EXO的典型特性。對(duì)給予A549標(biāo)記EXO的小鼠腦組織進(jìn)行NeuN免疫熒光染色，電鏡下被NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元為綠色。結(jié)果顯示，海馬區(qū)神經(jīng)元中出現(xiàn)紅色熒光，表明MSC-EXO經(jīng)尾靜脈注射后，可通過(guò)血-腦屏障進(jìn)入海馬神經(jīng)元。

A: MSC表面標(biāo)志物鑒定；B:免疫印跡檢測(cè)MSC-EXO特異性表面標(biāo)記CD9和TSG101；C: 電鏡觀察MSC-EXO(×43 000)；D:MSC-EXO示蹤(NeuN免疫熒光染色，×400)

2.2 3組小鼠海馬及皮層的Aβ陽(yáng)性面積 免疫組化染色后細(xì)胞核為藍(lán)色，神經(jīng)元內(nèi)或胞外組織間隙中存在的棕黃色或棕褐色顆粒及斑塊即為Aβ免疫染色陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果顯示，AD+saline組小鼠海馬及皮層的Aβ陽(yáng)性面積比對(duì)照組小鼠明顯增多，AD+EXO組小鼠海馬及皮層的Aβ陽(yáng)性面積較AD+saline組小鼠減少(圖2)。

A、B、C：免疫組化染色×40；D、E、F：免疫組化染色×100

2.3 3組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比較 見(jiàn)圖3。Nissl染色顯示，對(duì)照組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元排列整齊均勻，胞內(nèi)尼氏小體豐富，未見(jiàn)明顯的神經(jīng)元缺失。AD+saline組小鼠海馬DG區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量減少，胞內(nèi)尼氏小體大量脫失；DG區(qū)細(xì)胞層厚度與對(duì)照組相比顯著減小(P<0.01)。AD+EXO組小鼠海馬DG區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量較AD+saline組增多，DG區(qū)細(xì)胞層厚度與AD+saline組相比顯著增厚(P<0.05)。

A：神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量(Nissl染色，×30，×400)；B:細(xì)胞層厚度比較(*與AD+saline組比較P<0.05；**與對(duì)照組比較P<0.01)

2.4 3組小鼠海馬神經(jīng)元線粒體的改變 與對(duì)照組小鼠相比，AD+saline組小鼠海馬神經(jīng)元的線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴結(jié)構(gòu)改變等現(xiàn)象；而AD+EXO組小鼠海馬神經(jīng)元的線粒體僅有輕微腫脹，嵴結(jié)構(gòu)也近乎正常(圖4)。

A、B、C：×8 200；D、E、F：×16 500) A：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)；B：蛋白表達(dá)水平半定量分析

2.5 3組小鼠海馬Nrf2、Keap1及HO-1表達(dá)量比較 見(jiàn)圖5。與對(duì)照組相比，AD+ saline組小鼠海馬組織的Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著升高，而Keap1表達(dá)量顯著降低(均P<0.05)。與AD+saline組相比，AD+EXO組小鼠海馬組織的Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著降低，而Keap1表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)。

3 討 論

AD是以認(rèn)知障礙、記憶障礙、人格和行為改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[7]，已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為全球公共衛(wèi)生重點(diǎn)疾病。據(jù)報(bào)道，1990年至今中國(guó)AD的患病率約為3.4%，預(yù)計(jì)到2050年中國(guó)AD患者將達(dá)到2010年的2.52倍。目前AD的治療以對(duì)癥處理為主[8]，但臨床效果不佳，亟待研發(fā)新的治療思路和手段。

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞越來(lái)越受到重視，因其不僅有免疫原性低、成瘤性低的特性，還能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用，且具有多向分化潛能，可以預(yù)見(jiàn)其在治療AD方面有著良好的前景[9-13]。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)旁分泌的方式發(fā)揮作用[14]，可分泌包括生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、神經(jīng)源性營(yíng)養(yǎng)因子在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)。EXO作為細(xì)胞分泌的囊泡狀結(jié)構(gòu)，不僅攜帶有豐富的生物活性物質(zhì)等，無(wú)成瘤風(fēng)險(xiǎn)，更易保存和運(yùn)輸，在多種神經(jīng)退行性疾病的治療研究中已顯現(xiàn)出很好的療效[15,16]，但在AD的治療應(yīng)用研究報(bào)道較少。

目前的研究報(bào)道，AD的發(fā)病原因除了比較公認(rèn)的Aβ蛋白的生成和代謝紊亂假說(shuō)之外，Tau蛋白異常磷酸化、氧化應(yīng)激和自由基損傷、神經(jīng)炎癥、膽堿能假說(shuō)等也在AD的發(fā)生發(fā)展中起到了十分重要的作用[17-18]。本研究主要針對(duì)AD的Aβ異常堆積的病理機(jī)制及氧化應(yīng)激和自由基損傷假說(shuō)進(jìn)行探討。

本研究采用免疫組化技術(shù)對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)的Aβ沉淀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)MSC-EXO處理后AD小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積明顯減少；表明MSC-EXO減少了Aβ蛋白在小鼠腦內(nèi)的聚集。并采用尼氏染色對(duì)3組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行觀察，顯示與對(duì)照組相比，AD+saline組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元尼氏小體大量缺失，神經(jīng)元密度明顯降低，而AD+EXO組小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)t缺失明顯減少。這與本研究前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即MSCs-EXO可以靶向修復(fù)神經(jīng)元并促進(jìn)損傷腦組織中的神經(jīng)元再生[19]相一致；最近的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)[20]。這些研究結(jié)果表明MSCs-EXO可能在AD早期發(fā)揮延緩發(fā)病的作用。

在AD發(fā)病過(guò)程中，氧化應(yīng)激作為發(fā)病中的關(guān)鍵一環(huán)，可導(dǎo)致神經(jīng)元突觸膜及樹(shù)突棘的氧化損傷，影響突觸可塑性，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。氧化損傷還會(huì)導(dǎo)致包括能量代謝在內(nèi)的多種生理過(guò)程的酶活性的改變，造成神經(jīng)元損傷。Nrf2/Keap1是重要的氧化應(yīng)激信號(hào)調(diào)節(jié)通路，在維持體內(nèi)的氧化物和過(guò)氧化物平衡方面發(fā)揮著十分重要的作用[21]。前期研究已證明，在癲癇小鼠模型中MSC-EXO可以改善炎癥誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；此過(guò)程就涉及了Nrf2/Keap1通路[5]。本研究發(fā)現(xiàn)MSC-EXO可調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)Nrf2/Keap1信號(hào)通路；推測(cè)MSC-EXO可能是通過(guò)調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)通路影響線粒體氧化應(yīng)激，以達(dá)到改善神經(jīng)元和認(rèn)知功能的作用。

此外，氧化應(yīng)激會(huì)損傷線粒體膜，造成線粒體的形態(tài)損傷和功能失調(diào)。線粒體級(jí)聯(lián)損傷在AD發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮著十分重要的作用[22]。本研究通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AD+saline組小鼠海馬神經(jīng)元線粒體有明顯損傷，而經(jīng)EXO處理的AD+EXO組小鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷則明顯減輕。這也進(jìn)一步佐證了MSC-EXO可能通過(guò)改善氧化損傷發(fā)揮治療作用。

總之，本研究結(jié)果表明MSC-EXO在修復(fù)AD的神經(jīng)元損傷方面有良好的效果；因此，MSC-EXO未來(lái)可能為AD的臨床治療提供新的途徑。