樊雨梅 汝文文 張建嶺 解曉 廖峰

摘要 采用蛋白質(zhì)傳統(tǒng)分離技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF/MS）揭示驢胎盤蛋白質(zhì)的性質(zhì)和組成，結(jié)果表明，驢胎盤蛋白含量為（15.62±1.04）%，等電點均勻分布酸性和堿性區(qū)域，分子量主要集中在7～19、36～78 kD 2個區(qū)域。通過與馬科蛋白圖庫進行對比，檢索出3 865種可識別的蛋白，進一步對驢胎盤蛋白進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)驢胎盤蛋白主要參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、ECM-受體相互作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程，為驢胎盤藥理活性成分的篩選提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 驢胎盤;基本特性;蛋白質(zhì)組分;生物信息學(xué)

中圖分類號 S-822文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）11-0168-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.046

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Analysis of the Composition in Protein from Donkey Placenta

FAN Yu-mei1，2， RU Wen-wen1，2， ZHANG Jian-ling1，2 et al

（1. National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine， Donge，Shandong 252201;2. Dong-E-E-Jiao Co.， Ltd.， Donge， Shandong 252201）

Abstract SDS-PAGE gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF/MS were used to reveal the properties and composition of protein in donkey placenta.The results showed that the protein content of the donkey placenta was （15.62±1.04）%， the isoelectric point was evenly distributed in the acidic and basic regions， and the molecular weight was mainly concentrated in the two regions of 7-19 and 36-78 kD. By comparing with the equine protein library， 3 865 identifiable proteins were retrieved， and further analysis of donkey placental proteins was performed. It was found that donkey placental proteins were mainly involved in biological processes such as protein processing in endoplasmic reticulum， ECM-receptor interaction and response to endoplasmic reticulum stress. It provided a theoretical basis for the screening of donkey placenta pharmacologically active ingredients.

Key words Donkey placenta;Basic properties;Protein fraction;Bioinformatics

動物來源藥材是我國傳統(tǒng)藥物的重要組成部分，胎盤作為傳統(tǒng)中藥，經(jīng)過長期的實踐經(jīng)驗和現(xiàn)代科學(xué)研究證明，胎盤及其提取物具有抗氧化[1]、抗疲勞[2-3]、延緩衰老[4]、傷口愈合[5]、調(diào)節(jié)皮膚炎癥[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]和改善肝損傷[8-10]等作用。胎盤的生物活性與其所含有的化學(xué)成分密切相關(guān)[11-13]。目前研究表明，胎盤富含多種生物成分，包括免疫球蛋白、膠原蛋白、激素、生長因子、細胞因子、氨基酸、酶及微量元素等[12，14]。Togashi等[12，15]研究發(fā)現(xiàn)，人胎盤提取物的抗氧化活性與其所含的尿嘧啶、酪氨酸、苯丙氨酸有關(guān)。也有研究表明，胎盤蛋白及多肽是胎盤發(fā)揮抗氧化、傷口愈合、抗衰老、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[12-14，16-17]。

近年來，關(guān)于胎盤的研究國內(nèi)外學(xué)者主要集中在胎盤成分的檢測、動物胎盤功效成分的制備及其功效研究，但蛋白類成分的組成、鑒定研究較少。因此，筆者以驢胎盤為研究對象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二維電泳、圓二色譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF/MS）等技術(shù)手段揭示驢胎盤蛋白質(zhì)的分子量分布、等電點、二級結(jié)構(gòu)與組成，為驢胎盤的深層次開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢胎盤，山東天龍驢產(chǎn)業(yè)研究院;乙腈、甲酸、甲醇，均為質(zhì)譜純， 百靈威科技有限公司;牛血清白蛋白、尿素、二硫蘇糖醇，北京索萊寶科技有限公司;Tris-base，阿拉丁;PMSF，碧云天;Bio-Lyte 3-10 buffer、Ready Strip IPG Strips、Modified Trypsin（Sequencing Grade，Promega）、SDS-PAGE電泳Maker、CGE電泳Maker，美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動凱氏定氮儀（UDK159），意大利VELP公司;SDS-PAGE電泳儀（Mini Protean 3 Cell）、CGE電泳儀（P/ACETM MDQ）、2-DE電泳儀（Protean IEF cell），美國Bio-Rad公司;圓二色譜儀（MOS 450），法國Bio logic公司;MALDI-TOF/TOF-MS（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid）、多功能酶標儀（MULTISKAN GO），美國Thermos公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理。

取新鮮驢胎盤樣品，用生理鹽水沖洗干凈，并用手術(shù)器械去除筋膜和臍帶。生理鹽水浸泡并緩慢攪拌5 min，重復(fù)數(shù)次，直至去除淤血。瀝干水分后用液氮速凍，并打成粉末。

準確稱取2份5 g胎盤粉末，對于分析用樣品加入50 mL 含1 mmol/L PMSF 的Western和IP 細胞裂解液，對于純化蛋白的樣品加入50 mL pH 8.0 含100 mmol/L氯化鈉的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，使用高速勻漿機在低溫下勻漿，勻漿程序為勻漿30 s，間隔15 s。勻漿后離心去除沉淀，上清液即為驢胎盤粗提液。

1.3.2 蛋白質(zhì)特性的測定。

1.3.2.1 蛋白質(zhì)含量測定。

采用GB 5009.5—2016中凱氏定氮法[18] 測定驢胎盤中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.2.2 SDS-PAGE電泳測定蛋白質(zhì)分子量。

方法參考文獻[19]。驢胎盤粗提液按體積1∶1加入含二硫蘇糖醇的2 × Loading Buffer緩沖液，沸水浴5 min后取出。上樣量為10 μL，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%，分離膠12%。將凝膠掃描電子圖譜保存，電泳所用的marker分子量在7～207 kD。

1.3.2.3 毛細管凝膠電泳（CGE）分析蛋白質(zhì)相對豐度。

根據(jù)田蘭等[20]的方法稍作修改。毛細管規(guī)格為內(nèi)徑100 μm，總長31 cm，有效長度20 cm，柱體溫度40 ℃，電動進樣，進樣電壓-10 kV，進樣時間1 s，分離電壓-12.4 kV，紫外檢測波長280 nm，樣品儲存溫度30 ℃。

1.3.2.4 二維電泳（2-DE）分析蛋白質(zhì)等電點。

根據(jù)Wawrzykowski等[21]的方法，稍作修改。200 μL 驢胎盤粗提液與800 μL的水化液混勻，取200 μL加載到電泳池，準備完畢后，進行等點聚焦程序（表1）。

等電聚焦后立即進行膠條平衡。平衡分兩步，每次15 min，分別使用5 mL含1% DTT平衡液1和5 mL含2.5% IAM 平衡液2。平衡結(jié)束后進行第二向SDS-PAGE電泳。凝膠用考馬斯亮藍染色后，以脫色液脫去背景顏色，使用凝膠成像設(shè)備掃描成電子圖片保存。

1.3.3 圓二色譜法檢測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

采用參考文獻[22]中的方法，略有改動。驢胎盤蛋白經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜處理后在190～250 nm遠紫外區(qū)進行掃描，超純水作為空白。測定條件：0.1 cm 石英比色杯，溫度 25 ℃，光徑 0.1 cm，帶寬 1 nm，掃描速度 0.5 nm/s，用平均殘基摩爾橢圓率[θ]表示 CD 光譜數(shù)據(jù)，單位 deg·cm2/dmol，并使用 SELCON3 程序估算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml），匹配方式為Closest matching solution with all proteins。

1.3.4 蛋白質(zhì)組成分析。

驢胎盤經(jīng)SDS-PAGE分離后，條帶平均切成6份，移至 EP 管中。蛋白質(zhì)的脫色酶切方法參考文獻[21]，采用MALDI-TOF/TOF-MS 分析。利用Mascot軟件的SwissPort數(shù)據(jù)庫進行搜索。檢索分類（Taxonomy）為Equus caballus，Mascot檢索P< 0.05和Mascot得分>41分的結(jié)果被認為鑒定成功。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，用±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)

2.1.1 蛋白質(zhì)含量分析。

用凱氏定氮法測定驢胎盤蛋白質(zhì)含量為15.62%±1.04%，與唐文林[23]報道的豬胎盤蛋白質(zhì)含量為14.67%結(jié)果相似。

2.1.2 蛋白質(zhì)分子量分布。

驢胎盤蛋白電泳條帶清晰（圖1），分子量均勻分布（7～207 kD），與人胎盤[24]、豬胎盤[14，23，25]、鹿胎盤[26]、馬胎盤[27]、羊胎盤[28]、牛胎盤[29]提取物的電泳圖模式類似。由圖1可知，驢胎盤蛋白中主要含有8條條帶，主要分布于7～19和36～78 kD。

2.1.3 不同分子量蛋白質(zhì)豐度。

胎盤蛋白分子量由低至高均勻分布（圖2），且出峰位置非常多，說明胎盤蛋白質(zhì)種類較多，與前面SDS-PAGE結(jié)果一致。由圖2可知，驢胎盤蛋白主要分布在35～50 kD。

2.1.4 蛋白質(zhì)等電點。

驢胎盤蛋白的2-DE電泳結(jié)果如圖3所示，水平方向為第一向固相pH梯度等點聚焦，垂直向為第二向垂直板SDS-PAGE電泳。驢胎盤蛋白等電點范圍分布較廣，在酸性和堿性范圍內(nèi)均有相應(yīng)的等電點蛋白。

2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

采用圓二色譜法分析驢胎盤蛋白質(zhì)組分中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，驢胎盤蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的比例分別為9.7%、41.2%、21.7%和32.1%，可見驢胎盤蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，推測驢胎盤蛋白富含纈氨酸和異亮氨酸。

2.3 蛋白質(zhì)組成分析

利用SDS-PAGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS的方法，總共鑒定出3 865種蛋白質(zhì)，其中有301種蛋白為未命名蛋白。鑒定的驢胎盤蛋白種類低于Ner-Kluza等[29]報道的4 000多種牛胎盤蛋白，高于Miao等[30]報道的1 198種人胎盤蛋白和Lee等[31]報道的945種豬胎盤蛋白。鑒別出來的驢胎盤蛋白等電點和分子量的分布見圖4，這與上面GCE揭示的驢胎盤蛋白分子量分布一致，主要分布在30～50 kD。

通過基因本體論（gene ontology，GO）法對驢胎盤蛋白質(zhì)分別以其分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）和細胞組成（cell component，CC）3種方式進行歸類，揭示驢胎盤蛋白生物學(xué)功能，結(jié)果見圖5。驢胎

盤蛋白參與的生物過程主要是三羧酸循環(huán)、翻譯、小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖酵解、ATP水解耦合質(zhì)子傳輸、核小體組裝、細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、毒素轉(zhuǎn)運、蛋白折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等。驢胎盤蛋白參與形成的細胞組成過程有細胞外泌體、黏著斑、髓鞘、細胞膜、溶酶體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體及中間絲的構(gòu)建等。驢胎盤蛋白參與蛋白質(zhì)種類最豐富的分子功能為GTP結(jié)合、GTPase活性、結(jié)構(gòu)分子活性、聚（A）RNA結(jié)合、細胞骨架的結(jié)構(gòu)成分、ATP結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、GDP結(jié)合、NAD結(jié)合、鈣轉(zhuǎn)運ATP酶活性等。

對驢胎盤蛋白進行KEGG通路分析，尋找驢胎盤蛋白集中的生物學(xué)信號通路，以期了解驢胎盤蛋白主要參與的生物信號通路，為后續(xù)驢胎盤蛋白功效研究提供依據(jù)。驢胎盤蛋白參與的KEGG信號通路主要有抗生素生物合成、碳代謝、吞噬體、糖酵解/糖異生、黏著斑、代謝途徑、胞吞作用、TCA循環(huán)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、ECM受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控、白細胞穿越內(nèi)皮遷移、氧化磷酸化等。驢胎盤蛋白信號通路的富集結(jié)果為進一步深入了解驢胎盤蛋白可能的生物學(xué)意義，闡明驢胎盤提取物發(fā)揮傷口愈合、延緩衰老、抗皺和改善肝損傷等藥理活性的機制提供新的途徑和線索。

驢胎盤參與ECM受體相互作用信號通路的相關(guān)基因為ECM中的collagen、fibronectin、THBS2等和細胞膜上的整合素、CD44、syndecan、CD36、CD47，從另一角度證實了胎盤水溶性提取物治療傷口愈合與整合素α5β1介導(dǎo)炎癥因子調(diào)控纖連蛋白促進細胞的遷移和吞噬有關(guān)[32]。已有研究表明，黏著斑、ECM受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架調(diào)控等信號通路中的調(diào)控因子在骨骼肌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[33]，為驢胎盤肽促進骨骼肌成肌細胞增殖的作用機制和機理提供了新的途徑和線索[34]。

3 結(jié)論

該研究采用SDS-PAGE凝膠電泳、二維電泳、圓二色譜和MALDI-TOF/TOF/MS等手段揭示驢胎盤的性質(zhì)與組成，結(jié)果表明，驢胎盤蛋白質(zhì)的含量為15.62%±1.04%，等電點分布在酸性和堿性區(qū)域，分子量主要集中在7～19和36～78 kD 2個區(qū)域;驢胎盤蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主。通過與馬科蛋白圖庫進行對比，檢索出3 865種可識別的蛋白。GO分類和KEGG通路分析顯示，驢胎盤蛋白主要富集在GTP結(jié)合、GTPase活性、小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗生素生物合成、糖酵解/糖異生、代謝途徑、胞吞作用、TCA循環(huán)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、ECM-受體相互作用等。該研究為進一步探究與驢胎盤藥理活性相關(guān)蛋白質(zhì)組分、生物活性肽的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐，明確驢胎盤蛋白成分發(fā)揮藥理活性的機制提供了新的途徑和線索。

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