林倚莉，王煜姣，賈慶玲，譚人千，易志榮，李 莉，凌江紅，

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；3.重慶市永川區(qū)中醫(yī)院，重慶 402160）

胃癌（gastric cancer，GC）是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，由于診斷晚、預(yù)后差，成為全球癌癥死亡的第三大原因，其發(fā)病率高居全球惡性腫瘤第五位。流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，我國(guó)GC的患病人數(shù)每年以2.5%的速度增長(zhǎng)［1-2］。胃癌的發(fā)生經(jīng)歷了正常胃黏膜-炎癥-萎縮-腸上皮化生-異型增生-癌等階段，其中不完全性腸上皮化生和高級(jí)別異型增生病變有更高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為GC［3］。胃黏膜的腸上皮化生和（或）異型增生稱(chēng)為胃癌前病變（gastric precancerous lesions，GPL），是正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一個(gè)重要階段，深入研究GPL對(duì)于降低GC的發(fā)病率具有重大意義。本課題組采用MNNG綜合法誘導(dǎo)GC大鼠，研究該法誘導(dǎo)GPL大鼠和GC大鼠的最佳成模時(shí)間，觀察GC形成過(guò)程中胃組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)的變化，以期初步探討MNNG綜合法誘導(dǎo)GC大鼠形成過(guò)程中的胃黏膜病變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，4～6周齡，體質(zhì)量180 g左右，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003；使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 試劑 N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司（貨號(hào)：M0527）；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶有限公司（貨號(hào)：D8370）；水楊酸鈉購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司（貨號(hào)：S104176）；鹽酸雷尼替丁膠囊（佛山手心制藥有限公司），0.03%雷尼替丁SPF級(jí)大鼠顆粒飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司制作；HE染色及相關(guān)試劑耗材由廣西醫(yī)科大學(xué)科技樓免疫組化實(shí)驗(yàn)室提供；電鏡及相關(guān)試劑由廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供。

1.3 主要儀器 電子分析天平（日本Shimadzu公司）；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤烘烤片機(jī)均為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；UC7超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；HT7700透射電子顯微鏡（日本日立公司）；BX53F奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 藥物配置 取5 g的MNNG粉末，加入DMSO溶液約30 ml，使其充分溶解，再用超純水定容至濃度為17 mg/ml的母液，置于4℃冰箱避光保存，臨用前再取適量母液用超純水稀釋至濃度為170μg/ml。

1.5 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 36只大鼠予正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組和模型組各18只，正常組予常規(guī)自由飲食，模型組參照文獻(xiàn)［4］采用MNNG綜合法復(fù)制GC大鼠模型：①自由飲用MNNG溶液：取濃度為170μg/ml的MNNG溶液供大鼠自由飲用，每24 h更換1次，飲水瓶用錫箔紙包裹；②饑飽失常法：進(jìn)食2 d，再禁食1 d；③化學(xué)藥物損傷法：喂食含有0.03%雷尼替丁的顆粒狀SPF級(jí)大鼠飼料，于禁食當(dāng)天下午用2%水楊酸鈉溶液10 ml/kg灌胃。由于疫情管控原因，造模第35～46周委托動(dòng)物中心老師代予170μg/ml的MNNG溶液供大鼠自由飲用，并喂食含有0.03%雷尼替丁的顆粒狀SPF級(jí)大鼠飼料，此期間內(nèi)模型組大鼠死亡2只。

1.6 樣本采集與觀測(cè)指標(biāo) 觀察兩組大鼠在造模過(guò)程中的一般情況，如皮毛光澤、活動(dòng)度、精神狀態(tài)、飲食量及體質(zhì)量變化。分別于造模第20、24、28、32周末從兩組中各隨機(jī)處死3只大鼠，第48周末處死余下的大鼠。剖腹取胃小彎-胃體-胃竇的胃組織全層兩塊：一塊用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，用于HE染色，光鏡下觀察胃黏膜病理組織學(xué)變化；另一塊用4%戊二醛固定，電鏡下觀察胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠體態(tài)正常，皮毛順滑光澤，精神良好，行動(dòng)敏捷，飲食飲水量大，大便成形，呈黃色顆粒狀。與正常組比較，模型組大鼠體型瘦小，皮毛無(wú)光澤，毛發(fā)松散，掉毛多，精神倦怠，喜靜臥或昏昏欲睡，行動(dòng)遲緩，飲食飲水量明顯減少，體質(zhì)量顯著降低，大便多不成形，色黑，臭穢。

2.2 肉眼觀察大鼠胃組織 正常組大鼠胃部外觀大小形態(tài)正常，剖開(kāi)胃組織后偶見(jiàn)飼料殘?jiān)?，胃體部黏膜呈暗粉色，胃竇部黏膜呈粉白色，黏膜表面平整光滑，黏膜皺襞規(guī)律排列。與正常組比較，20周、24周模型組大鼠胃部外觀體積變小、形態(tài)正常，胃體部黏膜呈暗粉色，胃竇部黏膜呈粉黃白色，胃壁變薄，黏膜表面尚平整、欠光滑，皺襞走向紊亂，皺襞變淺。28周胃黏膜表面部分可見(jiàn)散在出血點(diǎn)。32周胃體部黏膜呈淺暗粉色，胃黏膜表面不平整，部分可見(jiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)。48周模型組大鼠剖腹后可見(jiàn)胃部脹大，剖開(kāi)胃組織可見(jiàn)大量臭穢黃褐色液體流出，胃體部黏膜呈淡暗粉色，胃竇部黏膜呈灰白色，胃壁變薄，黏膜表面缺乏光澤、不平整，皺襞走向紊亂，皺襞變淺或消失，胃竇部表面可見(jiàn)大小不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀腫物。見(jiàn)圖1。

圖1 肉眼觀察下各組胃組織形態(tài)

2.3 HE染色觀察大鼠胃黏膜病理變化 正常組胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層腺體形態(tài)正常，排列整齊規(guī)律，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。20周模型組大鼠可見(jiàn)胃小凹加深，腺體腺體排列相對(duì)較整齊，形態(tài)尚規(guī)則。24周、28周模型組大鼠胃黏膜腺體無(wú)明顯萎縮，腺體擁擠，形態(tài)不規(guī)則，排列稍紊亂，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞。32周模型組大鼠腺體擁擠，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)復(fù)層及背靠背改變，個(gè)別腺體囊狀擴(kuò)張，細(xì)胞核深染、增大、異型，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞。48周模型組大鼠胃黏膜腺體減少，排列紊亂，細(xì)胞核呈柱狀或桿狀，細(xì)胞呈多形性，異型性明顯，細(xì)胞核漿比增高，胞核增大，胞漿少，嗜堿性，可見(jiàn)較多核分裂象。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜病理觀察（×400）

2.4 透射電子顯微鏡觀察大鼠胃黏膜超微結(jié)構(gòu)變化 與正常組比較，模型組大鼠細(xì)胞間可見(jiàn)緊密連接數(shù)量較多、橋粒數(shù)量減少，連接復(fù)合體張力微絲減少、消失。20周、24周模型組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞輕度固縮，細(xì)胞核輕度固縮，局部核周隙略顯增寬，線粒體數(shù)量豐富，略顯固縮、較小，線粒體“空泡化”現(xiàn)象，膜內(nèi)基質(zhì)電子密度高，嵴擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，表面有核糖體附著，細(xì)胞間隙局部增寬。28周模型組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞輕度水腫，胞內(nèi)細(xì)胞器略顯腫脹，微絨毛稀疏、局部脫落，表面黏液消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)可見(jiàn)絮狀物聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留。32周模型組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞壞死趨勢(shì)，胞內(nèi)基質(zhì)電子密度高，微絨毛脫落，細(xì)胞核崩解，核膜消失，染色質(zhì)游離，線粒體數(shù)量減少，黏原顆粒數(shù)量減少，大小不一。48周模型組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞凋亡趨勢(shì)，胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹、空泡變，細(xì)胞膜局部破損，細(xì)胞器游離，細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊集，核周隙增寬，個(gè)別細(xì)胞染色質(zhì)塊狀凝集，核碎裂，線粒體明顯腫脹、變大，膜內(nèi)基質(zhì)變淡，嵴減少。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化（TEM，×5 000）

3 討論

GPL是正常胃黏膜向GC轉(zhuǎn)變的重要階段，包括腸上皮化生和（或）異型增生。目前GC及GPL動(dòng)物模型的造模方法較多，在造模動(dòng)物的選擇上，主要以雄性SD和Wistar大鼠為主，年齡多選擇4～8周的未成年大鼠或新生兒鼠，體質(zhì)量50～200 g不等［5］。在造模方法的選擇上，主要有化學(xué)藥物誘變法、物理方式刺激法、免疫造模法、幽門(mén)螺桿菌感染復(fù)制法以及手術(shù)造模法，其中，因化學(xué)藥物誘變劑MNNG不依賴于酶的代謝，可直接作用于胃黏膜誘發(fā)癌變，模擬人體過(guò)多攝入硝酸鹽而在胃中產(chǎn)生致癌物質(zhì)的過(guò)程，使其成為目前比較常用的造模方法［6-7］。然而由于單用MNNG造模周期長(zhǎng)，它常配合其他因素使用以縮短造模周期［8］。本研究采用MNNG自由飲用、饑飽失常法配合化學(xué)藥物損傷法復(fù)制GC大鼠模型。饑飽失常法模擬人體不規(guī)律飲食，水楊酸鈉模擬臨床中非甾體抗炎藥對(duì)胃黏膜的損傷，通過(guò)對(duì)局部胃黏膜的直接刺激引起炎性反應(yīng)，并通過(guò)抑制前列腺素合成，破壞胃黏膜屏障；另外，雷尼替丁可抑制胃酸分泌，與水楊酸鈉共同造成胃內(nèi)環(huán)境弱酸性，促使硝酸鹽轉(zhuǎn)為亞硝酸鹽，加快MNNG誘導(dǎo)作用［9-10］。

胃組織發(fā)生惡性腫瘤之前常歷經(jīng)持續(xù)多年的癌前病變過(guò)程，CORREA［11］于1988年首次提出GC的級(jí)聯(lián)發(fā)展模式：慢性淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生-胃癌，即慢性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”模式。胃黏膜上皮細(xì)胞是器官特異性的“屏障”，在發(fā)生感染或損傷時(shí)刺激趨化因子產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)快速免疫反應(yīng)，從而起到保護(hù)下層組織的作用［12］。有研究發(fā)現(xiàn)［13］，大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞在GC形成過(guò)程中經(jīng)歷著炎性反應(yīng)-空泡樣變與黏液湖-組織異型性-低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與微血管病變-癌變-轉(zhuǎn)移。GC的發(fā)生可能與胃上皮損傷引起的一系列細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，包括細(xì)胞空泡化、質(zhì)膜透化、內(nèi)體和溶酶體功能的改變、線粒體功能的破壞、自噬的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、壞死和T細(xì)胞活化的抑制等［14-15］。細(xì)胞增殖、分化與凋亡均為維持細(xì)胞平衡的重要機(jī)制，GPL的胃黏膜上皮細(xì)胞由于存在一些特異性基因突變，引起細(xì)胞的防御應(yīng)激機(jī)制，不能發(fā)生凋亡形式的程序性細(xì)胞死亡，使胃黏膜上皮細(xì)胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)，促使其向腫瘤發(fā)展［16］。

本研究使用4～6周齡、體質(zhì)量180 g左右的雄性SD大鼠，采用170μg/ml MNNG溶液自由飲用、喂食含0.03%雷尼替丁飼料、灌服2%水楊酸鈉溶液配合饑飽失常法復(fù)制GC大鼠模型。模型組大鼠飲食、飲水量減少，體質(zhì)量減輕，大便不成形，說(shuō)明GC形成過(guò)程中存在消化不良的癥狀。24周模型組大鼠胃組織皺襞變淺、出現(xiàn)杯狀細(xì)胞、胃黏膜上皮細(xì)胞輕度固縮，出現(xiàn)線粒體“空泡化”現(xiàn)象；28周胃組織表面可見(jiàn)散在出血點(diǎn)、杯狀細(xì)胞增多、胃黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留；32周胃組織表面部分可見(jiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)、出現(xiàn)異常增生、細(xì)胞壞死趨勢(shì)，微絨毛脫落，細(xì)胞核崩解；48周呈胃癌、細(xì)胞凋亡趨勢(shì)，胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹、空泡變。24周模型組大鼠胃組織可見(jiàn)杯狀細(xì)胞，說(shuō)明此造模方法可于造模第24周成功建立GPL大鼠模型。32周模型組大鼠胃組織出現(xiàn)異型增生，原實(shí)驗(yàn)計(jì)劃擬對(duì)造模第36周和40周大鼠胃組織進(jìn)行研究，但由于疫情防控期間管理規(guī)定未能按計(jì)劃實(shí)施，疫情期間模型組大鼠死亡2只，故動(dòng)物中心準(zhǔn)予開(kāi)放后僅取造模第48周大鼠胃組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠均已癌變，因此推測(cè)癌前病變向癌癥轉(zhuǎn)變的時(shí)間可能在32～48周。