唐海玲，秦學(xué)偉，溫杏莉，蔣夢婷，潘欣欣，農(nóng)靜連，陳 清

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530200）

腫瘤是全球范圍內(nèi)發(fā)病率高、最常見的人類致死性疾病之一。在不能進行手術(shù)治療的晚期腫瘤患者中，常使用順鉑、多柔比星、紫杉醇普通注射液等藥物進行化療，但化療藥物常伴隨嚴重的副作用［1-2］。紫杉醇白蛋白納米粒（Abraxane）、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體（Doxil）、紫杉醇脂質(zhì)體（力樸素）等可提高化療藥物的腫瘤靶向性，降低化療藥物的毒副作用，從而提高患者用藥的順應(yīng)性和安全性［3-4］。其中，脂質(zhì)體作為一種新型的藥物輸送載體系統(tǒng)，經(jīng)歷了近半個世紀的發(fā)展，到目前已有20個脂質(zhì)體藥品獲批上市銷售。2017年，F(xiàn)DA批準的首個被授予突破性療法的復(fù)方脂質(zhì)體Vyxeos，同時轉(zhuǎn)載柔紅霉素和阿糖胞苷，臨床療效明顯，使得復(fù)方脂質(zhì)體越來越受到關(guān)注［5］。

姜黃素（curcumin，CUR）是草本植物姜黃根莖中含不飽和芳香族基團的多酚類物質(zhì)，溶于乙醇，難溶于水，具有親脂性。已有文獻報道姜黃素具有抗氧化、抗癌、提高耐藥性腫瘤對化療藥物的敏感度等多種生理活性［6-7］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是不溶于水的四環(huán)二萜化合物，可作用于細胞微管蛋白，通過抑制微管的解聚，使腫瘤細胞的增殖處于停滯期，臨床上主要用于卵巢癌和乳腺癌的治療［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，將姜黃素和紫杉醇聯(lián)合使用，可以實現(xiàn)協(xié)同增效的作用。SREEKANTH等［10］制備了姜黃素脂質(zhì)體與紫杉醇-聚氧乙烯蓖麻油膠束聯(lián)用，在宮頸癌荷瘤小鼠模型中，觀察到姜黃素脂質(zhì)體可增強由紫杉醇引發(fā)的腫瘤細胞的抗凋亡因子和生存信號因子NF-κB、Akt的信號通路。JIANG等［11］制備了RGD修飾的姜黃素/紫杉醇復(fù)方脂質(zhì)體，實驗研究表明其能明顯抑制人肺腺癌細胞（A549細胞）的生長，體現(xiàn)了姜黃素與紫杉醇聯(lián)用的協(xié)同作用。

微流控芯片技術(shù)是在芯片上實現(xiàn)對微量流體動力學(xué)精確控制的一種技術(shù)手段，利用微流控芯片技術(shù)可以快速實現(xiàn)脂質(zhì)體制備工藝和處方的優(yōu)化篩選。NOBUHITO等［12］利用微流控技術(shù)制備了姜黃素脂質(zhì)體，使姜黃素脂質(zhì)體的載藥量提高了17%。本研究通過微流控芯片技術(shù)制備同時裝載姜黃素和紫杉醇的脂質(zhì)體（CUR-PTXL），利用單因素實驗篩出對微球性質(zhì)影響較顯著的因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化脂質(zhì)處方［13］，并通過實驗驗證可實現(xiàn)姜黃素和紫杉醇脂質(zhì)體穩(wěn)定包封的最優(yōu)處方，提高脂質(zhì)體樣品的儲存穩(wěn)定性。

1 實驗材料

1.1 儀器 FA1004電子天平［邦西儀器科技（上海）有限公司］；iNano Lab System快速納米藥物制備系統(tǒng)［邁安納（上海）儀器科技有限公司］；HT7700透射電子顯微鏡［日本日立（HITACHI）公司］；Quanta250掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；2A5-3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)［美國密理博（MILLIPORE）］；101-WB電熱恒溫干燥箱（浙江力辰儀器科技有限公司）；JP-040S潔盟牌超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；MD25透析袋（MW：1 000，VAKE）；人字型凹槽微流控芯片［邁安納（上海）儀器科技有限公司］；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化株式公司）；TGL-16G超速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MiniFlex600-CX射線衍射儀（日本理學(xué)）。

1.2 試劑和樣品 蛋黃磷脂酰膽堿（EPC）為廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；膽固醇（CHOL）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG 2000）為艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純）為成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；葡萄糖（分析純）為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氯化鈉（分析純）為天津市致遠化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；300目銅網(wǎng)普通碳膜為蘇州晶硅科技有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 CUR-PTX脂質(zhì)體樣品的制備 采用微流控芯片技術(shù)制備脂質(zhì)體樣品：配制含240 mg/ml EPC、20 mg/ml CHOL、120 mg/ml DSPE-PEG 2000的乙醇脂質(zhì)儲備液。利用INano快速納米制備儀制備脂質(zhì)體樣品，按處方量配制含CUR和PTX的脂質(zhì)乙醇相，以5%葡萄糖作為水相，設(shè)定制備參數(shù)：總流速20 ml/min，水相/乙醇相的體積比為9∶1，總體積為8 ml。制備所得的脂質(zhì)體樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，放置4℃保存。

2.2 CUR和PTX的HPLC含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取0.022 2 g姜黃素和0.022 8 g紫杉醇原料藥，置于50 ml容量瓶內(nèi)，以乙醇為溶劑，分別配制成含0.444 mg/ml姜黃素和0.456 mg/ml紫杉醇的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取100μl脂質(zhì)體樣品，加入900μl異丙醇渦旋破乳，破乳后的溶液5 000 r/min，離心5 min，吸取上清液，即為供試品溶液。

2.2.3 空白脂質(zhì)體樣品溶液的制備 配制含120 mg/ml EPC、20 mg/ml CHOL、12 mg/ml DSPE-PEG 2000的脂質(zhì)乙醇相，以5%葡萄糖為水相，利用INano快速納米制備儀制備空白脂質(zhì)體樣品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇。

2.2.4 色譜條件 Phenomenex Luna PFP 100?色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈（A）～0.1%乙酸水溶液（B），等度洗脫（0～15 min，60%A）；檢測波長：227 nm；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；進樣量：10μl。

2.2.5 標準曲線的建立 取對照品溶液適量，以乙醇為溶劑，分別將姜黃素和紫杉醇對照品溶液稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍，進行HPLC檢測。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得紫杉醇標準曲線方程為：Y=6×10-5X-0.002 7（R2=0.999 7），姜黃素標準曲線方程為：Y=5×10-5X-0.003 9（R2=0.997 4）。

2.2.6 專屬性和精密度考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和空白脂質(zhì)體樣品溶液適量，按照“2.2.4”項下色譜條件進行分析。結(jié)果CUR和PTX精密度分別為：2.4%±0.76%和1.5%±0.2%，專屬性良好，符合檢測要求。

2.2.7 CUR和PTX的含量檢測 取100μl脂質(zhì)體樣品，加入900μl異丙醇渦旋破乳，破乳后的溶液置于離心機中5 000 r/min離心5 min，吸取上清液直接進樣檢測CUR和PTX的含量。

2.3 脂質(zhì)體中CUR和PTX的包封率檢測 取1 ml

脂質(zhì)體樣品，于5 000 r/min條件下離心5 min，取上清液100μl，加入900μl異丙醇渦旋破乳，作為供試品溶液。取100μl的脂質(zhì)體樣品，直接加入900μl異丙醇渦旋破乳，作為對照品溶液。將處理后的樣品溶液放入4℃存放，統(tǒng)一檢測。進樣前，將樣品恢復(fù)室溫，在5 000 r/min下離心5 min，吸取上清液按照“2.2.4”項下的色譜條件進行CUR和PTX含量分析，計算出CUR和PTX的包封率。包封率（%）＝（脂質(zhì)體實際載藥量／理論投料量）×100%。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化CUR-PTX復(fù)方脂質(zhì)處方

2.4.1 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計和結(jié)果 根據(jù)單因素預(yù)試驗的考察結(jié)果，固定EPC在脂質(zhì)處方中濃度為120 mg/ml，以及CUR和PTX質(zhì)量比為1∶1，選擇對脂質(zhì)體包封率影響較大的3個因素進行考察，即乙醇相中CHOL、DSPE-PEG 2000、CUR+PTX濃度。將乙醇相中CHOL質(zhì)量濃度（3～6 mg/ml）、PTX+CUR的總質(zhì)量濃度（3～6 mg/ml）、DSPE-PEG 2000（0～24 mg/ml）作為自變量，以粒徑（Y1）、紫杉醇包封率（Y2）、姜黃素包封率（Y3）、放置15天姜黃素包封率（Y4）為因變量，進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，因素水平如表1所示。實驗安排及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計因素和水平表 （mg/ml）

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果

2.4.2 模型擬合 應(yīng)用Design Expert V10.0軟件對響應(yīng)曲面實驗數(shù)據(jù)進行Mean、Liner、2F1、Quadratic、Cubic、Quartic最優(yōu)方程擬合，對比不同的擬合模型，進行粒徑、包封率與各脂質(zhì)組分含量的相關(guān)性研究，結(jié)果見表3。

表3 粒徑和包封率響應(yīng)相關(guān)性方程擬合

其中，Y1和Y2的回歸方程擬合系數(shù)R2均＞0.97，可用于導(dǎo)航設(shè)計，表明在此模型的因素水平范圍可以預(yù)測脂質(zhì)體粒徑和紫杉醇包封率的實際情況。從Y1的響應(yīng)值模型，可得到B、（C）2、（A）2B的P值均＜0.01，（A）2C的P值＜0.1，表明PTX+CUR、DSPE-PEG 2000的含量對粒徑存在顯著性影響，PTX/CUR與CHOL、DSPE-PEG 2000與CHOL之間也存在交互作用，會顯著影響脂質(zhì)體樣品的粒徑。Y3和Y4的Quartic擬合顯示姜黃素第1天和放置第15天的包封率變化不明顯。選擇Linear擬合Y3時，B的P值＜0.05，說明PTX+CUR的含量對姜黃素包封率存在影響，此時Y3=0.97-0.015A-0.038B+0.009C。第15天姜黃素包封率的數(shù)值與各脂質(zhì)處方含量未呈現(xiàn)相關(guān)性。從粒徑和包封率響應(yīng)的非線性相關(guān)方程擬合結(jié)果來看，固定卵磷脂的含量，改變CHOL、PTX+CUR、DSPE-PEG 2000的含量，對粒徑和紫杉醇的包封率具有顯著影響。紫杉醇和姜黃素在磷脂膜層存在不同的包封行為，總體而言，姜黃素更容易被包封在脂膜內(nèi)，在脂膜內(nèi)的包封穩(wěn)定性未體現(xiàn)與脂膜組分相關(guān)的規(guī)律性。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)響應(yīng)面擬合方程，應(yīng)用Design Expert V10.0軟件進行方程的結(jié)果分析。在微流控芯片技術(shù)制備姜黃素和紫杉醇復(fù)方脂質(zhì)體時，選擇1 ml的乙醇脂質(zhì)溶液與9 ml 5%葡萄糖，以20 ml/min的流速進行混合。當固定卵磷脂的含量為120 mg/ml時，隨著PTX+CUR總濃度（3～6 mg/ml）的增加，粒徑在不斷的增大；CHOL對粒徑的影響也同樣受PTX/CUR的含量影響，兩者存在交互作用。在單因素分析中，固定CHOL和PTX+CUR的含量，隨著DSPE-PEG 2000含量的增加，粒徑會明顯的下降。當PTX+CUR的總濃度為3 mg/ml、CHOL濃度為4.2～4.8 mg/ml、DSPE-PEG 2000濃度為12～18 mg/ml時，制備得到的PTX/CUR的脂質(zhì)體粒徑分布最小。粒徑與各脂質(zhì)組分含量的相關(guān)性分析結(jié)果如圖1所示。紫杉醇包封率與各脂質(zhì)組分含量的變化如圖2所示，隨著PTX/CUR含量的增加，CHOL和DSPEPEG 2000的增加會降低PTX/CUR的包封率。

圖1 粒徑與各脂質(zhì)組分含量的相關(guān)性分析

圖2 紫杉醇和姜黃素的包封率與各脂質(zhì)組分含量的相關(guān)性分析

2.4.4 工藝驗證 考慮到實驗操作的可行性，根據(jù)Design Expert V10.0分析軟件綜合評價后，設(shè)定脂質(zhì)體制備的最優(yōu)處方為：EPC質(zhì)量濃度為120 mg/ml，CHOL質(zhì)量濃度為6 mg/ml，DSPE-PEG 2000質(zhì)量濃度為12 mg/ml，PTX+CUR質(zhì)量濃度為3 mg/ml，在此條件下，粒徑、紫杉醇包封率的預(yù)測值分別為104.2 nm和96.9%。按此處方同時制備CUR/PTX復(fù)方脂質(zhì)體，計算預(yù)測值與實測值的偏差，偏差＝（預(yù)測值－實測值）／預(yù)測值×100%。實際測得的粒徑為113.1 nm，偏差為7.8%；紫杉醇的包封率為96.2%，偏差為0.7%。表明響應(yīng)面法所建模型的預(yù)測性良好，方法可行，結(jié)果可靠。

2.5 CUR-PTX脂質(zhì)體的形貌觀察 取按優(yōu)選處方制備得到的脂質(zhì)體樣品適量，利用電子透射電鏡觀察脂質(zhì)體形貌，電壓設(shè)為100 kV。結(jié)果脂質(zhì)體呈球形，粒徑分布較為均一，見圖3。

圖3 CUR-PTX脂質(zhì)體透視電鏡形貌圖

2.6 CUR-PTX脂質(zhì)體的體外釋放 按優(yōu)選處方制備CUR-PTX脂質(zhì)體，取5 ml用pH 7.4 PBS定容至25 ml。分別取1 ml轉(zhuǎn)移至MW3500透析袋中，將透析袋置于900 ml釋放介質(zhì)（pH 7.4 PBS）中，100 r/min離心，37℃恒溫攪拌，分別在1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h取樣。按“2.2”項下方法測定姜黃素和紫杉醇的濃度，體外釋放試結(jié)果見圖4。

圖4 顯示，CUR-PTX脂質(zhì)體在pH 7.4 PBS介質(zhì)中存在緩慢釋放行為，4 h時CUR和PTX的釋放度分別為61.99%和47.93%；PTX和CUR存在明顯不同的釋放行為，其中PTX的釋放度在2 h后明顯低于CUR，這可能與PTX水中溶解度更低有關(guān)。24 h時，PTX的釋放度為86.02%，CUR的釋放度為92.21%，兩個藥物被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，在體外均體現(xiàn)了良好的緩釋行為。

圖4 CUR-PTX脂質(zhì)體體外釋放曲線圖

2.7 CUR-PTX脂質(zhì)體中脂質(zhì)成分對CUR和PTX晶型的影響 將X射線衍射（XRD）測試儀器的電壓設(shè)為40 kV，電流為15 mA，掃描角度范圍為3°～60°，掃描速度為10°/min。取按優(yōu)選處方制備的CUR-PTX脂質(zhì)體真空干燥，以及CUR、PTX、EPC、CHOL、DSPEPEG2000原料，記錄樣品X射線衍射曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 各脂質(zhì)組分和CUR-PTX脂質(zhì)體的XRD衍射峰

從圖5中可以看出，姜黃素原料藥粉末在衍射角（2θ）7.94°、8.88°、13.82°、14.52°、17.18°、21.14°、23.64°等處均出現(xiàn)尖銳的衍射峰，是典型的晶體衍射峰，表明姜黃素原料藥為晶體結(jié)構(gòu)；紫杉醇原料藥在衍射角（2θ）8.86°、9.98°、11.14°、15.60°、17.08°、21.96°、25.18°等處均出現(xiàn)尖銳的衍射峰；CHOL原料藥 在 衍 射 角（2θ）5.24°、10.07°、11.46°、12.68°、14.18°、16.94°、25.18°等處均出現(xiàn)尖銳的衍射峰；EPC原料藥在衍射角（2θ）7.20°、20.64°等處均出現(xiàn)尖銳的衍射峰；DSPE-PEG 2000在衍射角（2θ）19.08°、19.64°、25.88°等處均出現(xiàn)尖銳的衍射峰。而CUR-PTX脂質(zhì)體的干燥粉末在3°～60°衍射角（2θ）未出現(xiàn)明顯衍射鋒，峰形平緩，由此推測CUR和PTX以無定形的狀態(tài)分散在干燥的脂質(zhì)粉末中。

3 討論

制劑處方優(yōu)化是為了更好地提高藥物體內(nèi)的生物利用度、用藥安全性，發(fā)揮更好的臨床效果。脂質(zhì)體作為新型的藥物傳遞系統(tǒng)，構(gòu)成其基本結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)組分直接影響裝載藥物的體內(nèi)分布、代謝、排泄。本研究利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化姜黃素紫杉醇復(fù)方脂質(zhì)體處方，對影響姜黃素（CUR）和紫杉醇（PTX）包封率、脂質(zhì)體粒徑的磷脂輔料EPC、CHOL、DSPE-PEG 2000的用量進行了考察。在單因素試驗中，EPC含量的增加會提高CUR和PTX的包封率。隨著CUR和PTX含量的增加，脂質(zhì)體粒徑也會增大，這可能是由于CUR和PTX分布在磷脂膜雙層結(jié)構(gòu)內(nèi)，降低了脂膜的曲面張力［14-15］。

本研究選擇微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)了脂質(zhì)體的快速制備，微流控芯片技術(shù)是從分子水平構(gòu)建納米制劑的新技術(shù)，可以在微米尺寸的流體內(nèi)完成分子自組裝，以bottom-up方式形成納米制劑微觀結(jié)構(gòu)。為了更好地考察CUR、PTX與各脂質(zhì)組分的交互作用，將卵磷脂的濃度固定為120 mg/ml，改變CHOL、DSPE-PEG 2000的濃度，結(jié)果顯示，CHOL濃度的改變會明顯影響PTX的包封率，當CHOL濃度為6 mg/ml，PTX濃度從2 mg/ml增加到3 mg/ml時，PTX的包封率從90%下降到了70%。雖然固定了CUR與PTX的質(zhì)量比為1∶1，但兩種藥物在脂膜中的包封率行為并不一致。從Box-Behnken響應(yīng)面的實驗結(jié)果可以看出，CUR更容易穩(wěn)定地包封在脂膜中，且在設(shè)定的CHOL和DSPE-PEG 2000響應(yīng)曲面濃度范圍里，CUR不易受脂膜成分和含量的影響。

同時對按Box-Behnken響應(yīng)面法最終優(yōu)化的脂質(zhì)處方制備得到的脂質(zhì)體進行了體外釋放度的考察，選擇了pH 7.4 PBS作為釋放介質(zhì)，結(jié)果包封在脂質(zhì)體內(nèi)的姜黃素和紫杉醇均體現(xiàn)了明顯緩釋效果，1 h和2 h姜黃素和紫杉醇的釋放度分別為9.5%、19.6%和8.06%、26.5%，未出現(xiàn)包封藥物的突釋，表明姜黃素和紫杉醇可以穩(wěn)定地包封在脂質(zhì)體內(nèi)并實現(xiàn)緩慢釋放。響應(yīng)面實驗設(shè)計的處方2、處方3均可以觀察到脂質(zhì)粉末中姜黃素和紫杉醇結(jié)晶特征衍射峰都存在，說明CUR和PTX在脂質(zhì)體中是否為晶型結(jié)構(gòu)與能否有效包封裝載在脂質(zhì)體膜內(nèi)密切相關(guān)。通過對XRD衍射峰進行測定，發(fā)現(xiàn)紫杉醇和姜黃素包封率均高于95%的CUR-PTX脂質(zhì)體中，姜黃素和紫杉醇的特征結(jié)晶峰消失，強度減弱，表明CUR和PTX在磷脂雙分子層中晶型結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化，以無定型或分子形式存在，CUR和PTX能均一分散在脂質(zhì)體磷脂雙子層中。

利用響應(yīng)曲面法可以通過非線性模型擬合，充分考慮各影響因素間的交互作用。工藝驗證結(jié)果，預(yù)測值與真實值接近。通過響應(yīng)面法可以快速有效地對影響脂質(zhì)體質(zhì)量的關(guān)鍵處方因素進行優(yōu)化，有利于確定影響制劑穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。且按優(yōu)化處方制備所得的脂質(zhì)體形態(tài)圓整，粒徑分布均一，體外釋放緩慢，可為紫杉醇姜黃素聯(lián)合用藥提供了新型穩(wěn)定的脂質(zhì)載體系統(tǒng)。