石 磊 苗利娟 黃冰艷 高 偉 張忠信 齊飛艷 劉 娟 董文召 張新友,*

花生基因啟動(dòng)子及5'-UTR內(nèi)含子功能驗(yàn)證及其低溫脅迫應(yīng)答

石 磊1,2苗利娟1,2黃冰艷1,2高 偉3張忠信1,2齊飛艷1,2劉 娟3董文召1,2張新友1,2,*

1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院河南省作物分子育種研究院 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海油料作物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 河南省油料作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 花生遺傳改良國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州 450002;2河南生物育種中心有限公司, 河南鄭州 450002;3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 河南鄭州 450002

D12-脂肪酸脫氫酶基因()催化油酸生成亞油酸, 是決定油酸亞油酸比值的關(guān)鍵基因。高油酸花生對(duì)低溫更加敏感, 暗示在低溫響應(yīng)中發(fā)揮作用。為探索花生的低溫脅迫應(yīng)答, 本研究分析了花生的基因結(jié)構(gòu), 從普通油酸花生品種豫花9326中克隆了啟動(dòng)子和內(nèi)含子, 并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證了功能及其對(duì)冷脅迫的應(yīng)答。結(jié)果表明,包含2個(gè)外顯子和1個(gè)位于5'-UTR的內(nèi)含子;基因啟動(dòng)子功能較弱, 僅啟動(dòng)子在子葉期幼苗的子葉葉尖中觀察到藍(lán)色;假基因5'側(cè)翼序列具有啟動(dòng)子活性, 可調(diào)控基因在子葉、下胚軸、種子中表達(dá)。內(nèi)含子序列具有啟動(dòng)子的功能, 驅(qū)動(dòng)基因在幼苗下胚軸及子葉中表達(dá), 同時(shí)還有提高基因表達(dá)效率和擴(kuò)大表達(dá)范圍的功能, 是基因表達(dá)調(diào)控必需元件; 包含5'-UTR內(nèi)含子的啟動(dòng)子的調(diào)控序列功能受低溫脅迫抑制。

花生; Δ12-脂肪酸脫氫酶基因(); 啟動(dòng)子; 內(nèi)含子介導(dǎo)增強(qiáng); 冷脅迫; GUS報(bào)告基因

花生(L.)廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū), 其種子脂肪含量在50%左右, 是重要的油料作物之一。我國(guó)花生年種植面積約460萬(wàn)公頃, 產(chǎn)量約1700萬(wàn)噸(http://zzys.agri.gov.cn/ nongqing.aspx), 占世界總產(chǎn)量的40%左右, 是世界上最大的花生生產(chǎn)國(guó)。我國(guó)也是世界上最主要的花生消費(fèi)國(guó), 總產(chǎn)量的一半用來(lái)榨油, 花生油營(yíng)養(yǎng)豐富, 氣味醇香, 深受消費(fèi)者喜愛(ài)?；ㄉ椭胁伙柡椭舅嵊退?C18:1)和亞油酸(C18:2)含量約占脂肪酸總量的80%, 高油酸花生中油酸含量大于75%, 普通花生中油酸含量在35%～60%之間[1]。油酸比亞油酸更有益于健康, 并且有更好的風(fēng)味[2-3]和更穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì), 按照不同檢測(cè)方法計(jì)算, 油酸的氧化穩(wěn)定性比亞油酸高3.4～14.5倍[3], 導(dǎo)致高油酸花生及其制品不易酸敗, 有更長(zhǎng)的貨架期。因此油酸含量很大程度上決定了花生油及其他花生制品的品質(zhì), 是評(píng)價(jià)花生品質(zhì)的重要指標(biāo), 受到了育種家的高度關(guān)注, 培育和推廣高油酸花生品種成為當(dāng)前熱點(diǎn)。

Δ12-脂肪酸脫氫酶基因(,)通過(guò)催化油酸脫C12上的2個(gè)氫而引入雙鍵生成亞油酸[4], 是決定油酸含量的關(guān)鍵基因。的自然突變或化學(xué)誘變[5-9]以及通過(guò)基因工程方法沉默該基因[10-13]都可以產(chǎn)生高油酸性狀。研究表明, 通過(guò)提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性, 多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)在動(dòng)植物適應(yīng)冷脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14], PUFAs中的亞油酸含量在擬南芥[15]、大豆[16]中會(huì)隨著溫度的降低顯著升高。基因直接參與細(xì)胞膜冷脅迫適應(yīng)過(guò)程[17], 橄欖中參與低溫響應(yīng)[18-19], 棉花、花生、生菜冷脅迫后表達(dá)量顯著升高[17,20-22], 擬南芥突變體低溫條件下不發(fā)芽[23]。還參與其他非生物脅迫, 如擬南芥突變體耐鹽能力顯著下降[24], 部分受光調(diào)控[17], 植物特有防衛(wèi)相關(guān)化合物聚乙炔(polyacetylene)在生物合成前期受催化[25]。與普通花生相比, 高油酸花生在種子發(fā)芽期對(duì)低溫敏感, 出苗率低[26]。研究花生調(diào)控區(qū)功能及其對(duì)低溫脅迫的響應(yīng), 對(duì)解析高油酸花生的耐低溫性具有重要的意義。

本研究從普通油酸花生品種豫花9326中克隆了的調(diào)控序列, 并對(duì)序列及其順式作用元件進(jìn)行了分析, 通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證了功能及其對(duì)冷脅迫的應(yīng)答, 旨在為解析和提高高油酸花生的耐寒性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 花生(L.)品種豫花9326由本實(shí)驗(yàn)室選育, 為普通油酸花生, 種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。Columbia生態(tài)型擬南芥, 由本實(shí)驗(yàn)室保存, 種植于22℃ 16 h光照/ 20℃ 8 h黑暗的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株GV3101、植物表達(dá)載體pBI121由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌JM109感受態(tài)、pMD18-T克隆載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.3 試劑 植物DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司; 限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、Prime-Script RT Reagent Kit等購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司; PCR引物合成及DNA測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成; 其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 AhFAD2-1 5'端側(cè)翼序列、內(nèi)含子的克隆

利用花生基因(EF192432.1)序列, 在花生基因組信息網(wǎng)(https://www.peanutbase.org/home)中進(jìn)行BLAST比對(duì), 獲得花生基因5￠端側(cè)翼序列及內(nèi)含子序列, 根據(jù)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物(表1), 以花生葉片gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系10 μL, 包括模板0.2 μL、5× PrimeSTAR GXL緩沖液2 μL、2.5 mmol L–1dNTPs混合物0.8 μL、10 μmol L–1上游及下游引物各0.5 μL、PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(1.25 U μL–1) 0.2 μL, ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為98℃變性10 s, 55℃退火15 s, 68℃延伸5 min, 35個(gè)循環(huán); 68℃延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 切膠回收, 克隆至pMD18-T載體并測(cè)序。

表1 本研究所用引物及其序列

1.3 AhFAD2-1啟動(dòng)子序列分析

利用植物啟動(dòng)子在線分析網(wǎng)站PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)和plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)分析可能的順式作用元件。

1.4 AhFAD2-1啟動(dòng)子及內(nèi)含子缺失表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)引入的酶切位點(diǎn), 分別選擇對(duì)應(yīng)的I和I或I和I對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切, 用T4 DNA連接酶分別連接到經(jīng)對(duì)應(yīng)雙酶切后的pBI121質(zhì)粒上, 替換其CaMV35S元件, 構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pBI-P+intron、pBI- P+intron、pBI-P(pseudo)、pBI-P、pBI-P、pBI-、pBI-AhFAD2- 1B intron、pBI-AhFAD2-1B intron。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài), 利用PCR擴(kuò)增、雙酶切及測(cè)序(5￠-GGAA TTGTGAGCGGATAAC-3￠; 5￠-GCCCGGCTTTCTTG TAAC-3￠)鑒定陽(yáng)性克隆。提取質(zhì)粒, 凍融法轉(zhuǎn)化上述7個(gè)載體及pBI121至農(nóng)桿菌中, 鑒定陽(yáng)性克隆, 保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)化及GUS組織化學(xué)染色

花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。收集成熟種子, 在含50 mg L–1卡那霉素MS固體培養(yǎng)基上篩選抗性植株。CTAB法提取綠色健壯抗性苗DNA, 用轉(zhuǎn)化載體中對(duì)應(yīng)的特異引物PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性植株, 反應(yīng)條件為: 94℃ 5 min; 95℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。

對(duì)T2代種子進(jìn)行Kan抗性追蹤, 后代中綠苗和黃化苗比例接近3∶1的為單拷貝株系。取單拷貝株系的幼苗、根、莖、葉、花、角果、種子等組織置于GUS染色液(X-gluc 0.5 g L-1, 50 mmol L-1pH 7.0磷酸緩沖液, 10 mmol L-1EDTA, 0.5 mmol L-1鐵氰化鉀, 0.5 mmol L-1亞鐵氰化鉀, 0.01% Triton X-100, 20%甲醇)中, 抽真空10 min, 37℃溫浴過(guò)夜。用乙醇乙酸混合液(體積比為1∶1)將染色組織脫至無(wú)色, 分別用75%、50%、25%的乙醇洗滌3次, 顯微鏡下觀察, 并采集圖像。每個(gè)轉(zhuǎn)化載體隨機(jī)至少選取4個(gè)單拷貝獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行GUS染色分析, 保證其中3個(gè)株系染色結(jié)果一致。

1.6 脅迫試驗(yàn)

轉(zhuǎn)基因擬南芥種子播種于含50 mg L–1卡那霉素MS固體培養(yǎng)基上, 待出現(xiàn)第1片真葉后, 分別放置于10℃ 16 h光照/ 8℃ 8 h黑暗、15℃ 16 h光照/ 13℃ 8 h黑暗、22℃ 16 h光照/ 20℃ 8 h黑暗、30℃ 16 h光照/ 28℃ 8 h黑暗的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中進(jìn)行溫度脅迫試驗(yàn), 于1、2、4 d分別取樣染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhFAD2-1基因分析及啟動(dòng)子、內(nèi)含子的克隆

通過(guò)BLAST比對(duì), 獲得了3個(gè)同源序列, 1個(gè)位于Arahy 9 (A09)染色體114194542～ 114195863 (Identity=98.49%)之間, 命名為; 另2個(gè)分別位于Arahy 19 (B09)染色體154049703～ 154048379 (Identity=100%)和152798019～152796774 (Identity=97.04%) (pseudogene)之間, 后者序列中的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)對(duì)應(yīng)區(qū)第451位堿基由G突變?yōu)門(mén) (G451T), 形成終止密碼子TAA, 同時(shí)在673位堿基后存在1個(gè)GACTCAG的7 bp序列插入(圖1), 導(dǎo)致該基因只能編碼150 aa, 不能翻譯成完整379 aa的FAD2-1編碼蛋白, 因此為假基因, 這2個(gè)基因位點(diǎn)分別命名為和()。通過(guò)cDNA與DNA的序列比對(duì),包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子, 其中1個(gè)外顯子包含了整個(gè)ORF區(qū), 另1個(gè)外顯子和內(nèi)含子位于起始密碼子ATG上游的非翻譯區(qū)(圖1)。

以豫花9326基因組DNA為模板, 克隆了、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5￠上游1575 bp和2027 bp啟動(dòng)子序列, 分別命名為P和P(圖1); 克隆了、和()起始密碼子ATG 5￠上游包含啟動(dòng)子和內(nèi)含子的3247、3684和2967 bp序列, 分別命名為P+intron、P+intron和P(pseudo)(圖1); 克隆了的1567 bp內(nèi)含子序列, 命名為; 克隆了內(nèi)含子缺失片段, 命名為AhFAD2-1-intron、AhFAD2- 1B-intron。將上述目的片段連接到pBI121載體中, 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定, 獲得了陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

TSS: 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。TSS: the transcription start site.

2.2 AhFAD2-1啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

應(yīng)用在線分析網(wǎng)站PLACE和plantCARE對(duì)花生P、P及內(nèi)含子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。P起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游-24 bp (TAT AAA)或-45 bp (TATA)存在可能的真核生物RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn)TATA-box, 在-90 (CAAT)、-97 (CAAT)或-115 bp (CCAAT)存在可能的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄作用的CAAT-box; P的TATA-box可能位于-25 bp (ATTATATAA), CAAT-box可能位于-61 bp (CAAT)或-113 bp (CAAAT)。

和起始密碼子ATG 5￠上游序列具有同源性, 其中內(nèi)含子序列同源性為94%, P序列的-33～-679 bp與P序列的-1345～-1982 bp同源性為86% (圖1)。P特異性序列中發(fā)現(xiàn)有多種種子表達(dá)相關(guān)元件, 如DPBFCOREDCDC3 (ACACNNG)、PYRIMIDINEB OXOSRAMY1A (CCTTTT)、SEF4MOTIFGM7S (RTTTTTR)、ACGTABOX (TACGTA)等。P特異性序列中發(fā)現(xiàn)有葉肉細(xì)胞或葉片表達(dá)相關(guān)作用元件, 如MYBCORE (CNGTTR)、CACTFTPPCA1 (YACT)、RAV1AAT (CAACA)、MYBCORE (leaf)、DOFCOREZM (AAAG)、GATABOX (GATA)等。兩者同源序列中發(fā)現(xiàn)了多種種子表達(dá)相關(guān)順式作用元件, 如RY-element (CATGCATG)、SEF1MOTIF (ATATTTAWW)、DPBFCOREDCDC3 (ACACNNG)、SEF4MOTIFGM7S (RTTTTTR)、SEF3MOTIFGM (AACCCA)和EBOXBNNAPA (CANNTG)等; 根表達(dá)相關(guān)作用元件, 如ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT)、OSE2ROOTNODULE (CTCTT)、AUXREPSIAA4 (KGTCCCAT)、RAV1AAT (CAACA)。除此之外還有多種生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件: 低溫響應(yīng)作用元件或熱激元件LTR (CCGAAA)、CCAATBOX1 (Heat shock element) (CCAAT)、MYCCONSENSUSAT (CANNTG); 鹽誘導(dǎo)響應(yīng)作用元件GT1CONSENSUS (GAAAAA); 光響應(yīng)作用元件G-Box (CACGTT、TAAACGTG、TACGTG)、Box 4 (ATTAAT)、GT1-motif (GGTTAA); 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif (CGTCA)和TGACG-motif (TGACG); 脫落酸響應(yīng)元件ABRE (ACGTG); 赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif (TCTGTTG)和TC-rich repeats (GTTTTCTTAC)等。

2.3 AhFAD2-1啟動(dòng)子、內(nèi)含子及假基因5'側(cè)翼序列功能分析

GUS染色結(jié)果如圖2所示, P經(jīng)過(guò)染色后未發(fā)現(xiàn)任何組織具有顯示GUS活性的藍(lán)色; P僅在子葉期幼苗的子葉葉尖處觀察到藍(lán)色, 隨著苗齡增加藍(lán)色消失, 其他組織未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色。

序列具有啟動(dòng)子活性, 可以驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá), 在幼苗期的下胚軸及子葉中觀察到藍(lán)色, 當(dāng)內(nèi)含子缺失掉大部分序列, 僅保留與假基因同源的片段時(shí)(tron和AhFAD2-1B-intron), 沒(méi)有觀察到染色后呈藍(lán)色的組織, 說(shuō)明該同源序列不能發(fā)揮啟動(dòng)子的功能; P+intron在苗期的子葉和下胚軸中顯示藍(lán)色, 進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后, 擬南芥種子中的胚被染成藍(lán)色; P+intron子葉期幼苗子葉、下胚軸和根尖顯示藍(lán)色, 隨著苗齡增加, 蓮座葉及莖生葉染為藍(lán)色, 下胚軸藍(lán)色消失, 進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后, 花萼、柱頭、角果皮、種皮及胚都顯示藍(lán)色。綜合以上結(jié)果, P序列融合了內(nèi)含子后, 其啟動(dòng)效率及表達(dá)范圍都有明顯變化, 內(nèi)含子增強(qiáng)了啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率并擴(kuò)大了啟動(dòng)范圍。

P(pseudo)也具有啟動(dòng)子活性, 在幼苗子葉和下胚軸處觀察到了藍(lán)色, 進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后, 擬南芥種子中的胚被染成藍(lán)色。

2.4 低溫脅迫對(duì)PAhFAD2-1A+intron和PAhFAD2-1B+ intron的影響

高油酸花生種子在發(fā)芽期對(duì)低溫較為敏感, 為探討基因是否參與花生對(duì)低溫脅迫的響應(yīng), 觀察了轉(zhuǎn)P+intron和P+intron擬南芥幼苗在不同溫度處理下的染色情況。30℃環(huán)境中, P+intron驅(qū)動(dòng)GUS在擬南芥根尖中表達(dá), 而正常生長(zhǎng)的22℃環(huán)境中在根尖中不表達(dá), 其他組織中的表達(dá)模式?jīng)]有變化, 隨著溫度的降低和時(shí)間的延長(zhǎng), 10℃環(huán)境中第4天沒(méi)有觀察到藍(lán)色(圖3-A), 對(duì)照CaMV35S啟動(dòng)子在相同條件下染色模式?jīng)]有變化(圖3-B); P+intron在30℃環(huán)境中, 第1天蓮座葉和根中沒(méi)有觀察到藍(lán)色, 子葉的藍(lán)色變淡, 第2天和第4天GUS染色模式恢復(fù)正常, 與22℃環(huán)境中擬南芥的表達(dá)模式一致, 隨著溫度的降低和時(shí)間的延長(zhǎng), 在10℃環(huán)境中第4天根中的藍(lán)色消失, 葉子的藍(lán)色變淡(圖4)。說(shuō)明P+intron和P+intron驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的能力受到了低溫抑制。

3 討論

3.1 花生FAD2-1基因調(diào)控序列活性受低溫抑制

在發(fā)芽出苗期, 珍珠豆或多粒型花生品種溫度低于12℃, 普通型和龍生型花生品種溫度低于15℃時(shí)不能正常萌動(dòng)發(fā)芽[27]。我國(guó)北方春播花生在種子萌發(fā)期會(huì)遭遇“倒春寒”等低溫傷害, 造成種子腐爛、發(fā)芽率降低, 這限制了花生在我國(guó)北方高緯度地區(qū)的推廣。盡管花生中含有多對(duì)基因[21], 遺傳分析表明花生高油酸性狀僅由1對(duì)控制, 當(dāng)基因在448 bp處發(fā)生G-A突變, 導(dǎo)致AhFAD2-1A脫氫酶功能降低, 同時(shí)在441 bp后插入A導(dǎo)致AhFAD2-1B提前終止或在656和998 bp處插入微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable element, MITE)導(dǎo)致AhFAD2-1B翻譯不完全, 就引起花生的高油酸[5-6]。本研究分別克隆了的調(diào)控區(qū)域并驗(yàn)證了功能以及其對(duì)低溫的脅迫應(yīng)答。

A: 轉(zhuǎn)P+intron擬南芥; B: 轉(zhuǎn)CaMV35S擬南芥。1-day: 處理1 d; 2-day: 處理2 d; 4-day: 處理4 d。

A: P+intron transgenicplants; B: CaMV35S transgenicplants. 1-day: one day after treating; 2-day: two days after treating; 4-day: four days after treating.

1-day: 處理1 d; 2-day: 處理2 d; 4-day: 處理4 d。

1-day: one day after treating; 2-day: two days after treating; 4-day: four days after treating.

環(huán)境脅迫過(guò)程中植物受到傷害的主要部位是流動(dòng)雙層細(xì)胞膜, 較高含量的PUFAs有助于細(xì)胞膜的流動(dòng), 有助于植物在受到低溫脅迫后維持正常功能及低溫傷害后的功能恢復(fù)[28]?；驔Q定了PUFAs中亞油酸的含量, 在多種植物中受低溫誘導(dǎo)表達(dá)[17-22], 同時(shí)擬南芥突變體的耐冷性較野生型明顯降低[23], 說(shuō)明亞油酸在植物對(duì)抗低溫脅迫過(guò)程中具有重要作用。目前, 高油酸花生品種選育是花生育種的重要方向, 我國(guó)各花生育種單位通過(guò)連續(xù)回交育種結(jié)合基因標(biāo)記輔助選擇技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)有推廣品種的高油酸化改良[1,29-30], 高油酸花生后代與輪回親本的細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)完全一致, 細(xì)胞核遺傳物質(zhì)有96%以上的相似度, 兩者主要在油酸和亞油酸含量方面存在差異, 高油酸花生中雙突變導(dǎo)致亞油酸含量大幅降低,推測(cè)這是生產(chǎn)上部分高油酸花生不耐低溫的原因。本研究發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下基因調(diào)控序列的啟動(dòng)活性明顯受到抑制, 導(dǎo)致下游基因表達(dá)受限, 與薛曉夢(mèng)等[21]分析的高油酸花生品種ZH413中在低溫脅迫下的表達(dá)模式一致, 這可能是花生對(duì)冷脅迫敏感的原因之一, 高油酸花生中亞油酸含量較普通花生亞油酸含量更低, 導(dǎo)致高油酸花生對(duì)冷脅迫更為敏感。花生中含有多個(gè)基因, 表達(dá)模式各不相同[21,31], 部分與表達(dá)部位重疊, 這可能在一定程度上補(bǔ)償了功能的缺失, 降低了高油酸花生對(duì)冷脅迫的敏感性, 薛曉夢(mèng)等[21]的研究結(jié)果也認(rèn)為基因表達(dá)量降低不是低溫敏感的直接原因。因此, 不同遺傳背景的高油酸品種耐寒性是否與普通花生存在差異, 還需要進(jìn)一步探討, 同時(shí)在選育耐寒高油酸花生品種時(shí), 應(yīng)選用耐寒輪回親本作為改良對(duì)象, 保證后代對(duì)高緯度、寒冷地區(qū)的適應(yīng)性。

3.2 FAD2-1內(nèi)含子正調(diào)控啟動(dòng)子活性

不同物種的基因結(jié)構(gòu)保守, 都有2個(gè)外顯子和1個(gè)位于5'-UTR的內(nèi)含子[11,32-33]。內(nèi)含子長(zhǎng)度變化較大, 大豆為406 bp, 油菜為1077 bp, 擬南芥為1113 bp, 水稻為3148 bp, 且序列間沒(méi)有相似性。本研究中的基因結(jié)構(gòu)與其他物種相同,內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為1603 bp和1567 bp, 序列與其他物種不具相似性。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)含子有類(lèi)似啟動(dòng)子的功能且對(duì)基因的表達(dá)有正調(diào)控作用。擬南芥內(nèi)含子具備組成型表達(dá)活性, 與該基因5'端上游包含啟動(dòng)子的2411 bp序列功能相似[24], 且受植物激素的調(diào)控[34]; 芝麻內(nèi)含子不僅具備類(lèi)似啟動(dòng)子的功能, 其介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制還參與的種子特異性表達(dá)及其他的表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因擬南芥中啟動(dòng)子的表達(dá)效率提高100倍[35]; 油菜、內(nèi)含子序列中包含TATA-box和CAAT-box, 具備啟動(dòng)子活性, 同時(shí)增強(qiáng)上游啟動(dòng)子活性[36-37]。本研究中獲得的內(nèi)含子和啟動(dòng)子活性較弱, 內(nèi)含子對(duì)啟動(dòng)子具有正調(diào)控作用, 增強(qiáng)了啟動(dòng)子活性, 使在葉片或子葉和種子中得以表達(dá), 這與薛曉夢(mèng)等[22]分析的花生表達(dá)模式一致, 相比熒光定量PCR方法分析表達(dá)模式, 通過(guò)分析啟動(dòng)子功能鑒定的表達(dá)模式在組織上可更加細(xì)化。

3.3 AhFAD2-1B假基因可能具有可執(zhí)行功能

假基因是指由于個(gè)別堿基的突變或序列插入導(dǎo)致不能翻譯為有功能和全長(zhǎng)蛋白的缺陷拷貝, 被認(rèn)為是“基因組化石”, 主要有2種類(lèi)型: 一類(lèi)為“加工”型, 指mRNA轉(zhuǎn)錄本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后重新整合到基因組中, 隨后發(fā)生提前終止、移碼突變或截?cái)喽鴮?dǎo)致失活形成的假基因; 另一類(lèi)為“非加工型”, 指基因組序列經(jīng)過(guò)復(fù)制后插入到基因組, 復(fù)制基因由于功能冗余而發(fā)生失活形成的假基因, 假基因廣泛存在于生物體中[38-39]。盡管假基因是編碼蛋白的無(wú)效拷貝, 部分假基因仍可通過(guò)產(chǎn)生的調(diào)控RNAs (regulatory RNAs)在基本加工過(guò)程中起作用[39]。本研究中獲得的假基因()具有可執(zhí)行功能的啟動(dòng)子, 其起始密碼子5'上游序列含有的同源序列, 推測(cè)該假基因?yàn)椤胺羌庸ば汀? 是在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了復(fù)制, 并在長(zhǎng)期選擇過(guò)程中發(fā)生隨機(jī)突變后形成的。在第665堿基上的MITE插入可導(dǎo)致AhFAD2-1B喪失油酸脫氫酶活性[6], 肖鋼等[40]通過(guò)轉(zhuǎn)化釀酒酵母證明了甘藍(lán)型油菜基因組中的6個(gè)假基因沒(méi)有功能, 推測(cè)()編碼的150 aa的蛋白序列不具備油酸脫氫酶功能, 但作為可轉(zhuǎn)錄的假基因,()是否在轉(zhuǎn)錄水平上具有調(diào)控功能還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

克隆了花生基因及5￠上游調(diào)控序列, 通過(guò)轉(zhuǎn)基因證明了內(nèi)含子具有啟動(dòng)子活性并可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平,基因ATG 5'上游序列驅(qū)動(dòng)下游基因在種子中優(yōu)勢(shì)表達(dá),基因ATG 5￠上游序列驅(qū)動(dòng)下游基因在子葉、根尖、蓮座葉、莖生葉、柱頭及胚等組織中表達(dá), 同時(shí)調(diào)控序列的表達(dá)能力受低溫抑制。

[1] 黃冰艷, 齊飛艷, 孫子淇, 苗利娟, 房元瑾, 鄭崢, 石磊, 張忠信, 劉華, 董文召, 湯豐收, 張新友. 以分子標(biāo)記輔助連續(xù)回交快速提高花生品種油酸含量及對(duì)其后代農(nóng)藝性狀的評(píng)價(jià). 作物學(xué)報(bào), 2019, 45: 546–555.

Huang B Y, Qi F Y, Sun Z Q, Miao L J, Fang Y J, Zheng Z, Shi L, Zhang Z X, Liu H, Dong W Z, Tang F S, Zhang X Y., 2019, 45: 546–555 (in Chinese with English abstract).

[2] Zhao Z, Shi A, Wang Q, Zhou J. High oleic acid peanut oil and extra virgin olive oil supplementation attenuate metabolic syndrome in rats by modulating the gut microbiota., 2019, 11: 3005.

[3] Derbyshire E J. A review of the nutritional composition, organoleptic characteristics and biological effects of the high oleic peanut., 2014, 65: 1–10.

[4] Okuley J, Lightner J, Feldmann K, Yadav N, Lark E, Browse J.FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis., 1994, 6: 147–158.

[5] Jung S, Swift D, Sengoku E, Patel M, Teulé F, Powell G, Moore K, Abbott A. The high oleate trait in the cultivated peanut (L.): I. Isolation and characterization of two genes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases., 2000, 5: 796–805.

[6] Patel M, Jung S, Moore K, Powell G, Ainsworth C, Abbott A. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into thegene., 2004, 108: 1492–1502.

[7] Sturtevant D, Horn P, Kennedy C, Hinze L, Percy R, Chapman K. Lipid metabolites in seeds of diverseaccessions: molecular identification of a high oleic mutant allele., 2017, 245: 595–610.

[8] Long W, Hu M, Gao J, Chen S, Zhang J, Cheng L, Pu H. Identification and functional analysis of two new mutantalleles that confer elevated oleic acid content in rapeseed., 2018, 9: 399.

[9] Kulkarni K P, Patil G, Valliyodan B, Vuong T D, Shannon J G, Nguyen H T, Lee J D. Comparative genome analysis to identify SNPs associated with high oleic acid and elevated protein content in soybean., 2018, 61: 217–222.

[10] Tian Y, Chen K, Li X, Zheng Y, Chen F. Design of high-oleic tobacco (L.) seed oil by CRISPR-Cas9-mediated knockout of NtFAD2-2., 2020, 20: 233.

[11] Jung J H, Kim H, Go YS, Lee S B, Hur C G, Kim H U, Suh M C. Identification of functionalgene encoding microsomal delta-12 fatty acid desaturase fromand development ofcontaining high oleic acid contents., 2011, 30: 1881–1892.

[12] Do P T, Nguyen C X, Bui H T, Tran L T N, Stacey G, Gillman J D, Zhang Z J, Stacey M G. Demonstration of highly efficient dual gRNA CRISPR/Cas9 editing of the homeologousandgenes to yield a high oleic, low linoleic and α-linolenic acid phenotype in soybean., 2019, 19: 311.

[13] Chen Y, Fu M, Li H, Wang L, Liu R, Liu Z, Zhang X, Jin S. High oleic acid content, nontransgenic allotetraploid cotton (L.) generated by knockout ofgenes with CRISPR/Cas9 system., 2021, 19: 424-426.

[14] Suito T, Nagao K, Takeuchi K, Juni N, Hara Y, Umeda M. Functional expression of Δ12 fatty acid desaturase modulates thermoregulatory behaviour in Drosophila., 2020, 10: 11798.

[15] Welti R, Li W, Li M, Sang Y, Biesiada H, Zhou H E, Rajashekar C B, Williams T D, Wang X. Profiling membrane lipids in plant stress responses. Role of phospholipase D alpha in freezing- induced lipid changes in., 2002, 277: 31994–32002.

[16] Heppard E P, Kinney A J, Stecca K L, Miao G H. Developmental and growth temperature regulation of two different microsomal omega-6 desaturase genes in soybeans., 1996, 110: 311–319.

[17] Kargiotidou A, Deli D, Galanopoulou D, Tsaftaris A, Farmaki T. Low temperature and light regulate delta 12 fatty acid desaturases (FAD2) at a transcriptional level in cotton ()., 2008, 59: 2043–2056.

[18] Matteucci M, D’Angeli S, Errico S, Lamanna R, Perrotta G, Altamura M M. Cold affects the transcription of fatty acid desaturases and oil quality in the fruit ofL. genotypes with different cold hardiness., 2011, 62: 3403–3420.

[19] D’Angeli S, Altamura M M. Unsaturated lipids change in olive tree drupe and seed during fruit development and in response to cold-stress and acclimation., 2016, 17: 1889.

[20] Los D A, Ray M K, Murata N. Differences in the control of the temperature-dependent expression of four genes for desaturases insp. PCC 6803., 1997, 25: 1167–1175.

[21] 薛曉夢(mèng), 李建國(guó), 白冬梅, 晏立英, 萬(wàn)麗云, 康彥平, 淮東欣, 雷永, 廖伯壽. 花生基因家族表達(dá)分析及其對(duì)低溫脅迫的響應(yīng). 作物學(xué)報(bào), 2019, 45: 1586–1594.

Xue X M, Li J G, Bai D M, Yan L Y, Wan L Y, Kang Y P, Huai D X, Lei Y, Liao B S. Expression profiles ofgenes and their responses to cold stress in peanut., 2019, 45: 1586–1594 (in Chinese with English abstract) .

[22] 周婧雯, 丁玉嬌, 曾曉蓉, Ganesh K J, 劉寶林, 韓穎穎. 生菜種子低溫處理后耐凍性和脂肪酸合成代謝的關(guān)系研究. 亞熱帶植物科學(xué), 2020, 49: 9–14.

Zhou J W, Ding Y J, Zeng X R, Ganesh K J, Liu B L, Han Y Y. Relationship between freezing tolerance and fatty acid biosynthesis in lettuce seeds after low temperature treatment., 2020, 49: 9–14 (in Chinese with English abstract).

[23] Miquel M F, Browse J A. High-oleate oilseeds fail to develop at low temperature., 1994, 106: 421–427.

[24] Zhang J, Liu H, Sun J, Li B, Zhu Q, Chen S, Zhang H.fatty acid desaturase FAD2 is required for salt tolerance during seed germination and early seedling growth., 2012, 7: e30355.

[25] Feng T, Yang Y, Busta L, Cahoon E B, Wang H, Lyu S.gene radiation and positive selection contributed to polyacetylene metabolism evolution in campanulids., 2019, 181: 714–728.

[26] 張高華, 于樹(shù)濤, 王鶴, 王旭達(dá). 高油酸花生發(fā)芽期低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)基因分析. 遺傳, 2019, 41: 1059–1073.

Zhang G H, Yu S T, Wang H, Wang X D. Transcriptome profiling of high oleic peanut under low temperatureduring germination., 2019, 41: 1059–1073 (in Chinese with English abstract) .

[27] 萬(wàn)書(shū)波. 中國(guó)花生栽培學(xué). 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2003. pp 16–17.

Wan S B. Peanut Cultivation in China. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical publishers, 2003. pp 16–17 (in Chinese).

[28] Upchurch R G. Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress., 2008, 30: 967–977.

[29] 于明洋, 孫明明, 郭悅, 姜平平, 雷永, 黃冰艷, 馮素萍, 郭寶珠, 隋炯明, 王晶珊, 喬利仙. 利用回交法快速選育高油酸花生新品系. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43: 855–861.

Yu M Y, Sun M M, Guo Y, Jiang P P, Lei Y, Huang B Y, Feng S P, Guo B Z, Sui J M, Wang J S, Qiao L S. Breeding new peanut line with high oleic acid content using backcross method., 2017, 43: 855–861 (in Chinese with English abstract).

[30] 張照華, 王志慧, 淮東欣, 譚家壯, 陳劍洪, 晏立英, 王曉軍, 萬(wàn)麗云, 陳傲, 康彥平, 姜慧芳, 雷永, 廖伯壽. 利用回交和標(biāo)記輔助選擇快速培育高油酸花生品種及其評(píng)價(jià). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51: 1641–1652.

Zhang Z H, Wang Z H, Huai D X, Tan J Z, Chen J H, Yan L Y, Wang X J, Wan L Y, Chen A, Kang Y P, Jiang H F, Lei Y, Liao B S. Fast development of high oleate peanut cultivars by using marker-assisted backcrossing and their evaluation., 2018, 51: 1641–1652 (in Chinese with English abstract) .

[31] Wang Y, Zhang X, Zhao Y, Prakash C S, He G, Yin D. Insights into the novel members of the FAD2 gene family involved in high-oleate fluxes in peanut., 2015, 58: 375–383.

[32] Liu Q, Brubaker C L, Green A G, Marshall D R, Sharp P J, Singh S P. Evolution of the FAD2-1 fatty acid desaturase 5' UTR intron and the molecular systematics of(Malvaceae)., 2001, 88: 92–102.

[33] Zhang D, Pirtle I L, Park S J, Nampaisansuk M, Neogi P, Wanjie S W, Pirtle R M, Chapman K D. Identification and expression of a new delta-12 fatty acid desaturase () gene in upland cotton and its functional expression in yeast andplants., 2009, 47: 462–471.

[34] Yuan S, Wu X, Liu Z,Luo H,Huang R. Abiotic stresses and phytohormones regulate expression ofgene in., 2012, 11: 62–72.

[35] Kim M J, Kim H, Shin J S, Chung C H, Ohlrogge J B, Suh M C. Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoter and enhancers in the 5'-UTR intron., 2006, 276: 351–368.

[36] Xiao G, Zhang Z Q, Yin C F, Liu R Y, Wu X M, Tan T L, Chen S Y, Lu C M, Guan C Y. Characterization of the promoter and 5'-UTR intron of oleic acid desaturase () gene in., 2014, 545: 45–55.

[37] 劉睿洋, 劉芳, 張振乾, 官春云. 甘藍(lán)型油菜基因啟動(dòng)子及內(nèi)含子在表達(dá)水平的功能分析. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42: 1471–1478.

Liu R Y, Liu F, Zhang Z Q, Guan C Y. Functional analysis ofpromoter and intron at expression level in., 2016, 42: 1471–1478 (in Chinese with English abstract) .

[38] Harrison P M, Hegyi H, Balasubramanian S, Luscombe N M, Bertone P, Echols N, Johnson T, Gerstein M. Molecular fossils in the human genome: identification and analysis of the pseudogenes in chromosomes 21 and 22., 2002, 12: 272–280.

[39] Xie J, Li Y, Liu X, Zhao Y, Li B, Ingvarsson P K, Zhang D. Evolutionary origins of pseudogenes and their association with regulatory sequences in plants., 2019, 31: 563–578.

[40] 肖鋼, 張振乾, 鄔賢夢(mèng), 譚太龍, 官春云. 六個(gè)甘藍(lán)型油菜油酸脫氫酶(FAD2)假基因的克隆和分析. 作物學(xué)報(bào), 2010, 36: 435–441.

Xiao G, Zhang Z Q, Wu X M, Tan T L, Guan C Y. Cloning and characterization of six oleic acid desaturase pseudogenes of., 2010, 36: 435–441 (in Chinese with English abstract).

Characterization of the promoter and 5'-UTR intron ingenes from peanut and their responses to cold stress

SHI Lei1,2, MIAO Li-Juan1,2, HUANG Bing-Yan1,2, GAO Wei3, ZHANG Zong-Xin1,2, QI Fei-Yan1,2, LIU Juan3, DONG Wen-Zhao1,2, and ZHANG Xin-You1,2,*

1Henan Academy of Crops Molecular Breeding, Henan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crops in Huanghuaihai Plains, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Henan Provincial Key Laboratory for Oil Crops Improvement / National and Provincial Joint Engineering Laboratory for Peanut Genetic Improvement, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Henan Biological Breeding Center Co., Ltd., Zhengzhou 450002, Henan, China;3Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Delta-12 fatty acid desaturase 2 () catalyzes the conversion of oleic acid to linoleic acid and is the determination of the level of oleic to linoleic acid ratio (O/L) in peanut oil. Peanuts with high oleic acid content are more susceptible to cold stress than those with normal oleic acid content, suggesting thatplays important roles in response to cold stress. To explore the role ofs during the process of cold stress acclimation in peanut, the genomic structures ofwere determined; the function of promoters, intron ofand their response to cold stress were characterized by using β-glucuronidase (GUS) gene reporter system in transgenic. The results were as follows:genes consisted of two exons and one intron within their 5'-UTR; promoter ofwas too weak to be detected and the promoter ofpoorly activated the expression level ofin cotyledon tip of seedlings; the promoter ofpseudogene activatedexpression limited to cotyledon, hypocotyl, and seed. The intron ofdemonstrated promoter-like activity which was restricted in cotyledon and hypocotyl, and not only enhanced the gene expression efficiency but also expanded gene expression range. Intron-mediated enhancement was an essential aspect ofexpression. Activities of 5'-flanking region ofwere repressed by the cold stress.

peanut (L.); Δ12-fatty acid desaturase gene (); promoter; intron-mediated enhancement; cold stress; GUS reporter gene

10.3724/SP.J.1006.2021.04247

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“大田經(jīng)濟(jì)作物優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的生理基礎(chǔ)與調(diào)控”(2018YFD1000900), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-13)和河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(S2012-5)資助。

This study was supported bythe National Key Research and Development Program of China “Physiological Basis and Agronomic Management for High-quality and High-yield of Field Cash Crops” (2018YFD1000900), the China Agriculture Research System (CARS-13), and the Henan Province Agriculture Research System (S2012-5).

張新友, E-mail: haasz@126.com

E-mail: leis100@163.com

2020-11-17;

2021-03-19;

2021-03-31.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210331.1335.008.html