劉浩明，華 毛，張 莉，朱海宏

(青海省第五人民醫(yī)院1.胸外科；2.頭頸外科，青海 西寧810007；3.青海省人民醫(yī)院 胸外科，青海 西寧810007)

肺缺血/再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury, LI/RI)是指肺組織經(jīng)歷一定時(shí)間缺血再次恢復(fù)血流供應(yīng)后，其功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞出現(xiàn)加重的現(xiàn)象，是肺移植手術(shù)失敗和患者死亡的主要原因[1-3]。低氧誘導(dǎo)因子-1 α(hypoxic inducible facter 1α，HIF-1 α)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)信號(hào)通路與LI/RI密切相關(guān)，HIF-1 α是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，VEGF可促血管生成，該信號(hào)通路可在缺氧條件下被激活[4-5]。蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，研究報(bào)道，PKD2的表達(dá)可能影響組織缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/RI)后的細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)，在維持血管壁完整性、穩(wěn)定性中具有重要作用，但PKD2在LI/RI中的作用尚不清晰[6]。本研究建立小鼠LI/RI模型，以HIF-1 α/VEGF信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討PKD2對(duì)LI/RI的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6J野生型(WT)小鼠20只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)；PKD2基因過(guò)表達(dá)(PKD2+/+)小鼠40只(Jackson實(shí)驗(yàn)室)。實(shí)驗(yàn)小鼠均為6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。

1.1.2 試劑(盒)：戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、ECL發(fā)光液、PVDF轉(zhuǎn)印膜和Trizol(北京索萊寶科技有限公司)；2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2ME)、蛋白定量試劑盒、蛋白Marker(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；引物(TaKaRa公司)；HIF-1 α、VEGFA、GAPDH兔源重組單克隆抗體，羊抗兔二抗(CST公司)；中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理：將C57BL/6J WT小鼠和C57BL/6J PKD2+/+小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組(WS和PS組;W.WT; P.PKD2+/+)、LI/RI組(WIR和PIR組，無(wú)創(chuàng)顯微血管夾夾閉左側(cè)肺門60 min，松開血管夾再灌注120 min)和HIF-1α抑制劑2-ME組[(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組，造模前2 d腹腔注射20 mg/(kg·d)2ME]，每組10只[7]。

1.2.2 肺組織濕/干重比(W/D)的檢測(cè)：分離小鼠肺組織，記錄濕重(W)，然后放置于恒溫干燥箱(80 ℃)烘烤48 h，記錄干重(D)，濕重與干重之比即為W/D。

1.2.3 HE染色觀察肺組織病理變化：將肺組織置于4%多聚甲醛中固定處理48 h，制作組織切片，脫蠟、復(fù)水后行HE染色。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織中炎性因子：取大鼠肺組織，冰上勻漿，3 000 r/min離心取上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)肺組織HIF-1α和VEGFAmRNA表達(dá)：大鼠肺組織研磨勻漿后，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×緩沖液5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△Ct的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)肺組織HIF-1 α和VEGFA蛋白表達(dá)：提取各組大鼠肺組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL的HIF-1 α和VEGFA兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶2 000，4 ℃環(huán)境下孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶2 000)中，在37 ℃環(huán)境下孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的吸光度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白吸光度值/內(nèi)參蛋白吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕/干重比(W/D)值比較

WS組W/D值為(4.11±0.62)，PS組為(3.92±0.81)，WIR組為(7.80±1.10)，PIR組為(4.83±0.72)，WIR+2ME組為(10.02±1.19)，PIR+2ME組為(9.77±0.95)。與WS組比較，WIR組W/D值增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組W/D值降低(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組W/D值均增加(P<0.05)；但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 肺組織病理學(xué)形態(tài)比較

WS組和PS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡完整，肺間質(zhì)中未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；與WS組比較，WIR組小鼠的肺組織可見肺泡被明顯破壞并伴有水腫，肺泡腔中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出；與WIR組比較，PIR組小鼠的肺組織損傷程度較輕，肺泡和肺間質(zhì)輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，未見明顯出血現(xiàn)象；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組小鼠肺組織損傷進(jìn)一步加重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和充血水腫程度明顯(圖1)。

圖1 肺組織病理學(xué)形態(tài)比較

2.3 肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量則顯著減少(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組TNF-α、IL-1β和IL-6含量均升高(P<0.05)(圖2)。

A.TNF-α (pg/mL); B.IL-1β (pg/mL); C.IL-6 (pg/mL); *P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

2.4 肺組織HIF-1 α和VEGFA mRNA表達(dá)水平比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA的mRNA水平增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA的mRNA水平增加(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組HIF-1 α和VEGFA mRNA水平顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

2.5 肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達(dá)比較

與WS組比較，WIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與WIR組比較，PIR組小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與WIR和PIR組比較，(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組HIF-1 α和VEGFA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with WS group; #P<0.05 compared with WIR group; △P<0.05 compared with PIR group

3 討論

LI/RI是肺移植手術(shù)后器官衰竭和患者死亡的常見原因，其發(fā)生機(jī)制雖得到廣泛研究，但尚未完全闡明，也導(dǎo)致臨床缺乏有效的特異性藥物治療[8-9]。PKD家族是屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶的一組獨(dú)立蛋白激酶家族，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。研究表明，PKD2可增強(qiáng)部分組織和細(xì)胞對(duì)I/RI的耐受性，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，抑制炎性因子的表達(dá)[11]。目前，PKD2基因在LI/RI中的作用尚不清晰，因此，本研究構(gòu)建了PKD2基因過(guò)表達(dá)小鼠LI/RI模型，探究PKD2在LI/RI中的作用及其機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，WIR組小鼠肺組織W/D值高于WS組，肺組織損傷明顯，而PIR組小鼠W/D值降低，肺組織損傷減輕，表明PKD2基因高表達(dá)可改善小鼠肺組織損傷。LI/RI的顯著特點(diǎn)是疾病進(jìn)展過(guò)程中產(chǎn)生大量促炎因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LI/RI使小鼠肺組織炎性因子TNF-α、 IL-1β和IL-6的含量顯著增加，而PKD2過(guò)表達(dá)后炎性因子含量明顯降低，表明PKD2基因高表達(dá)可抑制炎性因子的釋放。哺乳動(dòng)物細(xì)胞普遍具有對(duì)缺氧或缺血性損傷的自我保護(hù)能力，HIF-1 α是這一過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。常氧條件下，HIF-1 α被大量降解，表達(dá)水平較低，在低氧條件下則被大量激活，調(diào)節(jié)下游VEGFA等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮在低氧環(huán)境中保護(hù)組織器官的代償作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，LI/RI使小鼠肺組織中HIF-1 α和VEGFA mRNA及蛋白表達(dá)增加，PKD2過(guò)表達(dá)后HIF-1 α和VEGFA mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加，表明PKD2基因高表達(dá)可能促進(jìn)HIF-1 α/VEGFA信號(hào)通路的活化。為了進(jìn)一步探究PKD2是否通過(guò)HIF-1 α/VEGFA信號(hào)通路調(diào)控LI/RI，我們對(duì)LI/RI小鼠使用了HIF-1 α抑制劑2-ME，結(jié)果顯示，HIF-1 α抑制劑使(WIR+2ME)和(PIR+2ME)組小鼠肺組織W/D值增加，肺組織損傷進(jìn)一步加重，炎性因含量均升高，PKD2對(duì)LI/RI的保護(hù)和改善作用被取消，而HIF-1 α mRNA及蛋白表達(dá)被2-ME降低的同時(shí)，VEGFA mRNA及蛋白表達(dá)亦顯著降低，(PIR+2ME)組上述指標(biāo)的變化與(WIR+2ME)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HIF-1 α/VEGFA信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)可減輕LI/RI，PKD2基因?qū)I/RI的調(diào)控是通過(guò)HIF-1 α/VEGFA信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，PKD2基因表達(dá)上調(diào)可改善小鼠LI/RI，其機(jī)制可能與增加HIF-1 α/VEGFA信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。