王海豫，肖 翼，黃 粵

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

干細(xì)胞(stem cells,SCs)是一類具有自我更新和分化能力的細(xì)胞，是早期胚胎研究中重要的體外模型。從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層可得到胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)系[1]、滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells, TSCs)系[2]和胚外內(nèi)胚層(extraembryonic endoderm,XEN)細(xì)胞系[3]。滋養(yǎng)外胚層參與到胎盤形成，圍繞在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)上部的滋養(yǎng)層干細(xì)胞發(fā)育成滋養(yǎng)外胚層和外胎盤錐，其余的則發(fā)育成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞[4]。

多倍體細(xì)胞常見于植物中，但在哺乳動(dòng)物的部分組織器官中也存在少量多倍體細(xì)胞。在人體內(nèi)，不同的組織中出現(xiàn)多倍體細(xì)胞的概率是0.5%～2%[5]，如骨髓的巨核細(xì)胞、胎盤中的滋養(yǎng)層細(xì)胞等[6]。在四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)(tetraploid complementation assay)中，將二倍體ESCs注射到四倍體囊胚中，經(jīng)發(fā)育可以最終得到完全由二倍體ESCs發(fā)育而來的個(gè)體[7]，四倍體胚胎發(fā)育成的胎盤等胚外組織，支持胎兒的發(fā)育。但四倍體細(xì)胞發(fā)育的胎盤與正常的二倍體細(xì)胞發(fā)育的胎盤有什么差異，目前尚不清楚。此外，四倍體ESCs系已經(jīng)成功建立，與二倍體ESCs僅能嵌合到胎兒組織的發(fā)育潛能不同，四倍體ESCs可以嵌合到胚胎期第13.5天(embryonic day 13.5, E13.5)和第16.5天(E16.5)小鼠的胎盤、胎膜等胚外組織中[8]。然而，四倍體滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells,TSCs)與二倍體TSCs相比，其發(fā)育潛能有哪些不同。以往報(bào)道的調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞功能的基因[9]，在多倍體細(xì)胞中如何進(jìn)行調(diào)控，尚未進(jìn)行探究。四倍體滋養(yǎng)層干細(xì)胞(tetraploid TSCs, TTSCs)系將有助于解決這些問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:野生型小鼠ESCs系A(chǔ)B2.2，遺傳背景為129S7/SvEvBrd，由英國The Wellcome Trust Sanger研究所Allan Bradley教授惠贈(zèng)。野生型小鼠TSCs系、 TTSCs系，遺傳背景為ICR(Institute of Cancer Research來源)，由本實(shí)驗(yàn)室自行建系獲得。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)制作成飼養(yǎng)層細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 實(shí)驗(yàn)用小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號：SYXK(京)2020-0025]，環(huán)境符合SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑:Knockout DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、GlutaMAXTM、丙酮酸鈉、MEM 非必需氨基酸溶液、青鏈霉素及β-巰基乙醇(Gibco公司)；白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)(Millipore公司)；血清(Hyclone公司)；成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor 4,FGF4)(Peprotech公司)；肝素(heparin)、M2培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司)；Y27632(MCE公司)；KSOM培養(yǎng)基(Merck公司)；TB Green Taq(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 ESCs的培養(yǎng):培養(yǎng)基M15L由Knockout DMEM、15% FBS、GlutaMAXTM、MEM NEAA、青鏈霉素、β-巰基乙醇、LIF(1 000 U/mL)配制而成。

1.2.2 TSCs的培養(yǎng):培養(yǎng)基TS+F4H：先由RPMI1640、20% FBS、GlutaMAXTM、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、青鏈霉素組成TS培養(yǎng)基，再添加FGF4(25 ng/mL)、肝素(1 μg/mL)組成TS+F4H培養(yǎng)基。

1.2.3 TTSCs的培養(yǎng):MEF條件培養(yǎng)基(condition-ed medium, CM)：用TS培養(yǎng)基培養(yǎng)X-射線處理的MEF細(xì)胞，3 d后收集上清，2 300×g4 ℃離心20 min，0.45 μm濾器過濾，即為MEF-CM。TTSCs的培養(yǎng)基70CM+1.5×F4H+Y27632：70% MEF-CM、30% TS培養(yǎng)基、FGF4(37.5 ng/mL)、肝素(1.5 μg/mL)、Y27632(20 μmol/L)組成。

ESCs、TSCs和TTSCs均接種在X線處理的飼養(yǎng)層MEF細(xì)胞上培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，以1∶5 ～1∶10比例進(jìn)行傳代。

1.2.4 TTSCs的分離:用M2培養(yǎng)基收集2-細(xì)胞期胚胎，清洗后置于電融合儀中，融合電壓30 V/ram，脈沖時(shí)程50 s，脈沖次數(shù)1次。1 h后選擇發(fā)生融合的胚胎在KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3 d后每3枚囊胚移入到MEF細(xì)胞包被的12孔板的一個(gè)孔中，使用TS+F4H培養(yǎng)，胚胎貼壁后更換新的培養(yǎng)基。3～5 d后，外長細(xì)胞團(tuán)(outgrowth)直徑達(dá)到600～800 μm，將其挑出消化成單細(xì)胞后，接入到MEF細(xì)胞包被的培養(yǎng)板中,使用70CM+1.5×F4H+Y27632培養(yǎng)。待長出單層上皮樣的克隆后，挑取克隆，傳代擴(kuò)增。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:提取細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TB Green Taq進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。引物序列見表1，GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光:細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1% Triton X-100室溫孵育20 min進(jìn)行通透處理，3% BSA溶液封閉30 min。加入CDX2(1∶200)、EOMES(1∶200)一抗4 ℃孵育過夜。次日加入二抗及Hoechst 33342稀釋液避光染色30 min。封片并使用共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá):TTSCs消化并去除MEF細(xì)胞后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg樣品進(jìn)行檢測，電泳、轉(zhuǎn)膜后，一抗CDX2(1∶1 000)、OCT4(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。TBST清洗后，二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光儀檢測。GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.8 中期染色體計(jì)數(shù):處于對數(shù)生長期的細(xì)胞加入0.2 μg/mL秋水仙素，3 h后將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，0.5% KCl 37 ℃水浴中低滲處理30 min。新配制固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)室溫固定細(xì)胞20 min，重復(fù)1次。細(xì)胞懸液滴于冰冷潔凈的載玻片上。過夜晾干，Giemsa染液染色5 min，蒸餾水沖洗晾干后，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。

1.2.9 慢病毒感染TTSCs:用PCR將2A-tdTomato元件克隆至pLVX-EF1α-eGFP-IRES-puro慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，得到pLVX-EF1α-eGFP-2A-tdTomato-IRES-puro質(zhì)粒, 作為核心質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝(由北京伊美昂生物科技有限公司制作)。

處于對數(shù)生長期的TTSCs接種到12孔板中，次日更換含polybrene(6 μg/mL)和慢病毒的無雙抗70CM+1.5×F4H +Y27632培養(yǎng)基，感染4 h后換液。48 h后，熒光顯微鏡下觀察評估感染效率。在培養(yǎng)基中加入puromycin(5 μg/mL)進(jìn)行篩選，獲得成功感染的細(xì)胞。

1.2.10 8-細(xì)胞期胚胎的顯微注射及嵌合胎盤的觀察:體質(zhì)量12～14 g ICR雌鼠作為胚胎供體鼠，每只注射10 U血促性素，間隔48 h后，注射10 U 絨促性素，與雄鼠合籠。次日晨挑取見陰道栓雌鼠，當(dāng)天記為E0.5 d(0.5 d)。在E2.5 d(2.5 d)時(shí)，用M2培養(yǎng)基收集8-細(xì)胞期胚胎。

將eGFP-2A-tdTomato標(biāo)記的TTSCs消化成單細(xì)胞，每個(gè)8-細(xì)胞期胚胎注射進(jìn)入5個(gè)細(xì)胞。注射后的胚胎放入KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。次日選取發(fā)育較好的囊胚進(jìn)行子宮移植。E13.5(13.5 d)時(shí)，取子代小鼠胎盤進(jìn)行觀察，檢測熒光標(biāo)記細(xì)胞的嵌入情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電融合后的胚胎建立滋養(yǎng)層樣細(xì)胞系

2-細(xì)胞期胚胎經(jīng)電融合后形成四倍體胚胎,體外培養(yǎng)至囊胚階段(圖1A)，將其接種到MEF細(xì)胞包被的培養(yǎng)板中，用TS+F4H培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。囊胚從透明帶中孵出，貼壁生長形成外長細(xì)胞團(tuán)(outgrowth)(圖1B)。挑出的outgrowth重新接種，在培養(yǎng)板中增殖生長形成新的細(xì)胞團(tuán)(圖1C)，細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待出現(xiàn)較多形態(tài)類似于TSCs的克隆后，挑取TSCs樣克隆繼續(xù)培養(yǎng)，得到可穩(wěn)定培養(yǎng)的TTSCs系(圖1D)。

A.mouse tetraploid blastocysts (scale bar=100 μm); B.outgrowth from tetraploid blastocysts(scale bar=200 μm); C.cell aggregates from outgrowth (scale bar=200 μm); D.cultured TTSCs that can be passaged stably (scale bar=200 μm)

2.2 鑒定四倍體滋養(yǎng)層干細(xì)胞系

對來自融合胚胎的TSCs樣細(xì)胞系進(jìn)行中期染色體計(jì)數(shù)后，超過60%樣品的染色體數(shù)目為80條，為正常二倍體細(xì)胞染色體數(shù)目的兩倍，說明所建立的細(xì)胞系為四倍體(圖2A)。在轉(zhuǎn)錄水平檢測上述細(xì)胞系中標(biāo)志基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不同的TSCs樣細(xì)胞系TTSCs-1和TTSCs-2均表達(dá)TSCs特異基因CDX2和EOMES，不表達(dá)ESCs特異性基因OCT4(圖2B)。Western blot(圖2C)和免疫熒光(圖2D)結(jié)果分別驗(yàn)證了TTSCs高表達(dá)CDX2、EOMES等因子。以上結(jié)果表明由融合胚胎建立的TSCs樣細(xì)胞系為四倍體細(xì)胞，并表達(dá)TSCs的標(biāo)志基因。

A.representative chromosome spreads and chromosome counting of TTSCs lines(×400); B.RT-qPCR analysis of TSCs marker gene (CDX2, EOMES, GATA3) and ESCs marker gene (OCT4) in TTSCs-1/2, TSCs, n=3), compared with TSCs; C.Western blot analysis of CDX2 and OCT4 in TTSCs-1/2, TSCs, ESCs; D.immunofluorescence staining of CDX2 and EOMES

2.3 TTSCs的體外分化

TTSCs在增殖條件下(圖3A)和分化條件下(圖3B)的細(xì)胞形態(tài)不同，在分化條件下(TS培養(yǎng)基)，TTSCs的細(xì)胞核明顯增大，具有滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的形態(tài)特征。用RT-qPCR對TTSCs進(jìn)行滋養(yǎng)層巨細(xì)胞標(biāo)志基因PL-1、PL-2、HAND1、GATA3的檢測。結(jié)果顯示，分化標(biāo)志基因在不同的時(shí)間點(diǎn)，TSCs與TTSCs的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.0001)(圖3C)。

A.the morphology of TTSCs clone under proliferation condition and DAPI stained nuclei(scale bar=100 μm); B.the morphology of TTSCs clone under differentiation condition and DAPI stained nuclei(scale bar=100 μm); C.RT-qPCR analysis of the expression of PL-1，PL-2，GATA3 and HAND1 under differentiation n=3); *P<0.000 1 compared with TSCs at day 0

2.4 TTSCs的體內(nèi)分化

通過慢病毒感染的方法得到同時(shí)帶有tdTomato和eGFP標(biāo)記的TTSCs(圖4A)。將其注射入8-細(xì)胞期胚胎中(圖4B)，并培養(yǎng)至囊胚期，可觀察到部分熒光標(biāo)記過的細(xì)胞分布在囊胚的滋養(yǎng)層部分(圖4C)。將囊胚移植入假孕雌鼠體內(nèi)發(fā)育至E13.5(13.5 d)，子代鼠的胎盤組織中可檢測到具有雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞(圖4D)。

A.TTSCs were labeled with dual fluorescent reporters of tdTomato and eGFP(scale bar=100 μm); B.TTSCs were microinjected into the 8-cell embryo(scale bar=100 μm); C.blastocysts cultured for 24 hours in vitro after microinjection(scale bar=100 μm); D.the E13.5 placenta dissected for observation(scale bar=2 mm); the two amplified pictures are matched with circled part of the above pictures(scale bar=1 mm)

3 討論

本研究使用電融合的方法，獲得了四倍體胚胎，借鑒二倍體[10]及單倍體[11]TSCs的建系方法，經(jīng)過建系條件和培養(yǎng)條件的反復(fù)測試，建立了TTSCs系，并確定了70CM+1.5×F4H+Y27632的培養(yǎng)條件可以穩(wěn)定維持TTSCs的生長。建立的TTSCs細(xì)胞系均表達(dá)TSCs標(biāo)志基因CDX2、EOMES。與二倍體TSCs相比，TTSCs培養(yǎng)基中需要添加更高濃度的肝素和FGF4以維持其增殖狀態(tài)，并且需要添加Rock 抑制劑Y27632,否則細(xì)胞會分化成滋養(yǎng)層巨細(xì)胞，說明其本身可能就具有更強(qiáng)的分化傾向。后續(xù)的分化實(shí)驗(yàn)也顯示，在體外培養(yǎng)條件下，TTSCs的分化標(biāo)志基因表達(dá)水平與TSCs存在顯著差異。說明在生長及分化過程中，TTSCs與TSCs并不完全相同。顯微注射實(shí)驗(yàn)也證明，TTSCs可以參與到胎盤的發(fā)育中，表明TTSCs具有良好的體內(nèi)發(fā)育潛能。

Wen[8]等建立的四倍體ESCs可嵌合入胚外組織，說明細(xì)胞染色體組多倍化會改變細(xì)胞的命運(yùn)決定機(jī)制及發(fā)育分化方向。通過體外建立的TTSCs可以進(jìn)一步分析和研究四倍體胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長及分化特點(diǎn)，解釋細(xì)胞染色體組多倍化對細(xì)胞生命活動(dòng)的影響。

綜上，本研究建立的TTSCs為研究多倍體細(xì)胞在動(dòng)物生理過程中的功能和胎盤早期發(fā)育提供了重要的細(xì)胞模型，也為深入了解胎盤發(fā)育不良導(dǎo)致的流產(chǎn)、難產(chǎn)等問題提供了新的研究思路。