葛程童, 褚文寧, 姚善涇, 林東強(qiáng)

新型人血白蛋白分離介質(zhì)吸附性能及重組人血白蛋白分離

葛程童, 褚文寧, 姚善涇, 林東強(qiáng)

(浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

針對(duì)畢赤酵母發(fā)酵液中分離重組人血白蛋白(rHSA)，采用新型介質(zhì)IAA-CYS，探討HSA吸附性能，優(yōu)化分離條件，實(shí)現(xiàn)rHSA高效分離?？疾炝瞬煌琾H和鹽濃度下IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的吸附，發(fā)現(xiàn)pH為4.5是最佳條件，HSA飽和吸附容量達(dá)到157.6 mg×mL-1，鹽濃度影響較小。測(cè)定了不同NaCl濃度和線性流速下 IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的動(dòng)態(tài)載量，發(fā)現(xiàn)流速影響較大，合適流速為100 cm×h-1；鹽濃度影響較小，無(wú)需對(duì)酵母發(fā)酵液進(jìn)行稀釋預(yù)處理，rHSA動(dòng)態(tài)載量達(dá)48.3 mg×mL-1。進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵液中分離rHSA，上樣pH為4.5，上樣流速為100 cm×h-1，上樣量為38.6 mg×mL-1，在pH為5.0和質(zhì)量濃度為400 mg×mL-1的NaCl條件下淋洗，在pH為8.0和質(zhì)量濃度為200 mg×mL-1的NaCl條件下洗脫，rHSA純度為90.1%，收率為88.6%。結(jié)果表明，IAA-CYS介質(zhì)分離rHSA條件溫和，耐鹽性好，料液無(wú)需稀釋預(yù)處理，過(guò)程簡(jiǎn)便高效，具有良好的應(yīng)用前景。

人血白蛋白；層析介質(zhì)；吸附性能；蛋白分離

1 前 言

人血白蛋白(human serum albumin，HSA)是人血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，臨床上HSA主要用于治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷、整形外科手術(shù)及腦損傷引起的低蛋白血癥以及肝硬化、腎水腫等惡性病變，在癌癥和艾滋病人放化療的輔助治療中也有較大需求[1]。目前治療用HSA只能通過(guò)健康人血漿分離得到，由于血漿來(lái)源有限，HSA供給十分緊張，且存在血源性病原體的潛在風(fēng)險(xiǎn)，采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人血白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)有助于解決相關(guān)問(wèn)題。rHSA已在真菌、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等多種系統(tǒng)中成功表達(dá)[2-4]，但發(fā)酵液成分非常復(fù)雜，除培養(yǎng)基成分外，還含有宿主細(xì)胞分泌的蛋白、多肽、脂質(zhì)、多聚糖和色素等代謝產(chǎn)物，以及宿主細(xì)胞破碎后釋放的核酸等雜質(zhì)，rHSA分離純化難度大，目前尚未有注射級(jí)的rHSA產(chǎn)品上市[5]。此外，pH對(duì)HSA結(jié)構(gòu)有較大影響，在pH為4.3～8.0時(shí)，HSA分子以生理?xiàng)l件下的N型結(jié)構(gòu)存在[6-10]。當(dāng)pH小于2.7時(shí)，HSA分子呈延展的E型結(jié)構(gòu)；當(dāng)pH為2.7～4.3時(shí)，HSA分子呈快速遷移的F型結(jié)構(gòu)；當(dāng)pH為8～10時(shí)，HSA分子無(wú)α螺旋結(jié)構(gòu)，呈B型結(jié)構(gòu)；當(dāng)pH大于10時(shí)，HSA分子呈A型結(jié)構(gòu)。因此，分離過(guò)程需控制合適pH，過(guò)酸或過(guò)堿均會(huì)造成HSA構(gòu)象變化，影響生理活性。

陽(yáng)離子交換層析常用于分離rHSA，如Goodey等[11]采用陽(yáng)離子交換介質(zhì)SP Sepharose FF從釀酒酵母發(fā)酵液中捕獲rHSA，選擇性較低，且離子交換介質(zhì)耐鹽性差，需要稀釋料液使得電導(dǎo)率低于5.5 mS×cm-1?；诙喾N相互作用的混合模式層析，可以有效組合疏水和靜電相互作用，提高分離選擇性[12-15]。李梅彥等[16]采用混合模式介質(zhì)CST-II FF從畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA，該介質(zhì)具有較強(qiáng)的耐鹽性，但是選擇性不高，在吸附后需要使用高濃度的NaCl溶液沖洗，以去除色素、糖、核酸和宿主細(xì)胞蛋白等雜質(zhì)。楊代常等[17]采用混合模式介質(zhì)Capto MMC從水稻種子提取物中分離rHSA，吸附后用濃度為1 mol×L-1的NaCl溶液沖洗，以去除吸附的雜質(zhì)。Chu等[18-19]采用混合模式介質(zhì)MX-Trp-650 M從畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA，經(jīng)優(yōu)化，rHSA純度可達(dá)到95%。不過(guò)，最佳上樣pH為4.0，可能影響HSA分子正常構(gòu)象。Wu等[20-21]以色胺為配基的新型混合模式介質(zhì)，用于酵母發(fā)酵液中分離rHSA，rHSA單體純度達(dá)到87.8%。此外，疏水相互作用層析也用于rHSA分離，如Dong等[22]采用雙水相萃取結(jié)合疏水相互作用層析，從畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA，純度達(dá)99.1%。為了提高rHSA分離效率，研發(fā)特異性的新型分離介質(zhì)，吸附和洗脫pH條件溫和，且具有耐鹽吸附特性，具有重要的意義。

基于計(jì)算機(jī)分子模擬輔助設(shè)計(jì)方法，以HSA的位點(diǎn)II為靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)設(shè)計(jì)和篩選得到HSA的特異性配基吲哚-3-乙酸-半胱氨酸(IAA-CYS)，將其偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，制備了新型混合模式介質(zhì)(IAA-CYS介質(zhì))，配基結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[23]。本研究基于前期工作，實(shí)驗(yàn)考察IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的吸附性能，針對(duì)畢赤酵母發(fā)酵液電導(dǎo)率較高、pH對(duì)HSA結(jié)構(gòu)影響較大的特點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注pH和鹽濃度對(duì)rHSA分離的影響，優(yōu)化分離條件，從畢赤酵母發(fā)酵液中高效分離rHSA。

圖1 IAA-CYS介質(zhì)的配基結(jié)構(gòu)示意圖[23]

2 材料與方法

2.1 材料

IAA-CYS介質(zhì)：本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)方法制備[20-21,23]，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，經(jīng)烯丙基溴活化，偶聯(lián)IAA-CYS配基，配基濃度為175 μmol×mL-1，介質(zhì)粒徑為45～165 μm，平均粒徑約90 μm；HSA(相對(duì)分子量66 700)：Sigma公司；畢赤酵母發(fā)酵液：本地生物制藥公司提供，pH為6.0，rHSA質(zhì)量濃度為8 mg×mL-1，純度3.9%，電導(dǎo)率為20 mS×cm-1；辛酸鈉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白Marker：上海天能科技有限公司；畢赤酵母宿主細(xì)胞蛋白檢測(cè)試劑盒：Cygnus公司；其他為市售分析純?cè)噭?/p>

2.2 HSA吸附等溫線

配制20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH=4.5)和添加200 mmol×L-1NaCl的20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)。IAA-CYS介質(zhì)用去離子水充分清洗，并用相應(yīng)緩沖液平衡30 min，抽濾15 min；稱(chēng)取0.03 g抽干介質(zhì)，置于2 mL離心管；采用相應(yīng)緩沖液配制成不同質(zhì)量濃度(2.4～9.6 mg×mL-1)的HSA溶液，分別取0.8 mL加入離心管中；將離心管放入25 ℃、轉(zhuǎn)速為1 200 r×min-1恒溫混勻儀振蕩3 h，達(dá)到吸附平衡；以3 000 r×min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，沉降介質(zhì)；用One Drop OD-1000+分光光度計(jì)測(cè)定上清液在280 nm波長(zhǎng)下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到HSA的平衡濃度(mg×mL-1)。根據(jù)物料衡算計(jì)算IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的吸附量(mg×mL-1)。采用Langmuir 吸附平衡式對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，得到飽和吸附容量m(mg×mL-1)和結(jié)合常數(shù)a(mL×mg-1)。Langmuir 吸附平衡式如下：

2.3 HSA動(dòng)態(tài)載量

1 mL IAA-CYS介質(zhì)裝填于Tricorn 5/50層析柱(內(nèi)徑5 mm，GE Healthcare公司)，填充高度5 cm。以質(zhì)量濃度為10 mg×mL-1的HSA溶液(pH 4.5)或含有濃度為200 mmol×L-1NaCl的質(zhì)量濃度為10 mg×mL-1的HSA溶液(pH=4.5)作為上樣料液。上樣前，用平衡緩沖液充分平衡介質(zhì)。上樣流速分別為100、200 和300 cm×h-1。UV280 nm在線檢測(cè)層析柱出口處的HSA濃度變化，繪制穿透曲線，計(jì)算10% 穿透時(shí)IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的動(dòng)態(tài)載量DBC10%(mg×mL-1)。上樣結(jié)束后，用20 mmol×L-1磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗脫HSA，再用0.1 mol×L-1的NaOH溶液進(jìn)行介質(zhì)清洗和再生。

2.4 畢赤酵母發(fā)酵液預(yù)處理

離心去除發(fā)酵液中的畢赤酵母細(xì)胞，上清液中加入辛酸鈉至20 mmol×L-1濃度，68 ℃水浴30 min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，迅速冷卻至室溫，滴加乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，以轉(zhuǎn)速1 000 r×min-1離心15 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾，得到畢赤酵母發(fā)酵處理液，rHSA質(zhì)量濃度為7.6 mg×mL-1，純度為4.0%。

2.5 rHSA動(dòng)態(tài)載量

1 mL IAA-CYS介質(zhì)裝填于Tricorn 5/50層析柱中，填充高度為5 cm。用20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5，含200 mmol×L-1的NaCl)平衡床層，以畢赤酵母發(fā)酵處理液為上樣料液，上樣流速為100 cm×h-1。每0.5 mL收集流穿組分，用SEC-HPLC分析流穿液中的rHSA濃度，繪制穿透曲線，計(jì)算10% 穿透時(shí)IAA-CYS介質(zhì)對(duì)rHSA的動(dòng)態(tài)載量。上樣結(jié)束后，用20 mmol×L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗脫rHSA，再用0.1 mol×L-1的NaOH溶液進(jìn)行介質(zhì)清洗和再生。

2.6 洗脫條件優(yōu)化

采用20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)、20 mmol×L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、7.0、8.0)和20 mmol×L-1甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0)配制不同pH和NaCl濃度(200、400、600、800、1 000 mmol×L-1)的緩沖液。96孔過(guò)濾板的30個(gè)孔中分別加入80 μL IAA-CYS介質(zhì)懸浮液(含有8 mg介質(zhì))，真空抽濾；各孔介質(zhì)用200 μL、20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5，含200 mmol×L-1的NaCl)平衡3次，真空抽濾，去除緩沖液；各孔加入48 μL畢赤酵母發(fā)酵處理液，用封板膜密封96孔過(guò)濾板的頂部和底部，放入25 ℃、1 200 r×min-1恒溫混勻儀振蕩20 min，真空抽濾；用200 μL、20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5，含200 mmol×L-1的NaCl)清洗介質(zhì)2次；各孔加入不同pH和NaCl濃度的緩沖液，用封板膜密封96孔過(guò)濾板的頂部和底部，放入25 ℃、轉(zhuǎn)速為1 200 r×min-1恒溫混勻儀振蕩10 min，真空抽濾，收集洗脫液，重復(fù)2次，合并洗脫液。用SEC-HPLC分析上樣料液和洗脫液，計(jì)算rHSA純度和收率。

2.7 畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA

1 mL IAA-CYS介質(zhì)裝填于Tricorn 5/50層析柱。20 mmol×L-1乙酸鈉緩沖液(pH 4.5，含200 mmol×L-1的NaCl)平衡介質(zhì)，以畢赤酵母發(fā)酵處理液為上樣料液，上樣量為38.6 mg×mL-1，上樣流速為100 cm×h-1；上樣后先用20 mmol×L-1的乙酸鈉緩沖液(pH 4.5，含200 mmol×L-1的NaCl)淋洗，再用20 mmol×L-1的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0，含200 mmol×L-1的NaCl)洗脫rHSA，收集洗脫液；最后用0.1 mol×L-1的NaOH溶液進(jìn)行介質(zhì)清洗和再生。采用SDS-PAGE、SEC-HPLC和ELISA試劑盒分析上樣料液和洗脫液。

2.8 SDS-PAGE分析

將10 μL電泳緩沖液與40 μL樣品混合，95 ℃金屬浴10 min。分離膠濃度為10 %，濃縮膠濃度為5 %，樣品上樣量為10 μL，蛋白Marker上樣量為5 μL，80 V恒壓電泳30 min，120 V恒壓分離45 min，考馬斯亮藍(lán)染色，采用Quantity One軟件(Bio-Rad公司)分析凝膠圖像。

2.9 SEC-HPLC分析

采用TSK G3000SWXL分析柱(TOSOH公司)和LC-10A液相色譜儀(島津公司)，流動(dòng)相為0.2 mol×L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0，異丙醇體積分?jǐn)?shù)為1 %)，流速為0.6 mL×min-1，上樣體積為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，室溫下進(jìn)行。

2.10 ELISA分析

按照畢赤酵母宿主細(xì)胞蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 HSA吸附等溫線

考察了pH和鹽濃度對(duì)IAA-CYS介質(zhì)吸附HSA的影響，發(fā)現(xiàn)在pH為4.0～5.0和NaCl濃度為0～1.0 mol×L-1時(shí)，HSA吸附量均高于100 mg×mL-1，最合適的吸附pH為4.5。進(jìn)一步測(cè)定了pH為4.5條件下，不添加NaCl和添加濃度為200 mmol×L-1的NaCl時(shí)IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的吸附等溫線，結(jié)果見(jiàn)圖2。pH為4.5和不添加NaCl時(shí)，HSA飽和吸附容量高達(dá)157.6 mg×mL-1，結(jié)合常數(shù)為7.1 mL×mg-1。褚文寧等[18-19]測(cè)定了4種商業(yè)化混合模式介質(zhì)(Capto adhere、Capto MMC、MX-Trp-650M和Nuvia cPrime)對(duì)HSA的吸附性能，最佳吸附的pH分別為8.5、4.0、4.0和4.0；吳啟賜等[20-21]研發(fā)了混合模式新介質(zhì)TA-B-6FF，也測(cè)定了HSA吸附性能，最佳吸附pH為5.0。與上述5種混合模式介質(zhì)比較，在各自的最佳吸附pH條件下，IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的飽和吸附容量最高。pH為4.5和添加200 mmol×L-1的NaCl時(shí)，IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的飽和吸附容量降到119.8 mg×mL-1，結(jié)合常數(shù)增大到12.5 mL×mg-1。與上述5種混合模式介質(zhì)比較，發(fā)現(xiàn)相同條件下IAA-CYS介質(zhì)的飽和吸附容量高于Capto adhere、Nuvia cPrime和TA-B-6FF，與Capto MMC介質(zhì)接近，略低于MX-Trp-650M介質(zhì)，且吸附pH較為溫和，有利于維持HSA的正常生理構(gòu)象[6-8]。結(jié)果表明，IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA吸附容量高，條件溫和，耐鹽性好。

圖2 IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的吸附等溫線(pH 4.5)

3.2 HSA動(dòng)態(tài)載量

考察了pH為4.5，不同NaCl濃度和線性流速下IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的動(dòng)態(tài)載量，穿透曲線見(jiàn)圖3，10% 穿透的動(dòng)態(tài)載量比較見(jiàn)圖4。當(dāng)線性流速為100 cm×h-1、不添加NaCl時(shí)，HSA動(dòng)態(tài)載量達(dá)到59.1 mg×mL-1。與Capto adhere、Capto MMC、MX-Trp-650M、Nuvia cPrime和TA-B-6FF等5種混合模式介質(zhì)比較，在各自最佳吸附pH條件下，IAA-CYS介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量高于Capto MMC、MX-Trp-650M和Nuvia cPrime介質(zhì)，略低于Capto adhere介質(zhì)和TA-B-6FF介質(zhì)。添加200 mmol×L-1的NaCl時(shí)，HSA動(dòng)態(tài)載量仍較高，達(dá)到55.2 mg×mL-1，高于上述5種混合模式介質(zhì)在相同條件下的HSA動(dòng)態(tài)載量。結(jié)果表明，NaCl濃度對(duì)HSA動(dòng)態(tài)載量影響較小，進(jìn)一步證實(shí)IAA-CYS介質(zhì)具有較強(qiáng)的耐鹽吸附特性。畢赤酵母發(fā)酵液的電導(dǎo)率與200 mmol×L-1NaCl溶液相當(dāng)，故無(wú)需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行稀釋處理，可以直接上樣分離。

圖3 不同線性流速下IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的穿透曲線

從圖4可知，線性流速對(duì)HSA動(dòng)態(tài)載量影響較大。不添加NaCl，線性流速?gòu)?00增大到200 cm×h-1，HSA動(dòng)態(tài)載量從59.1下降到44.8 mg×mL-1，下降了24.2%；當(dāng)線性流速繼續(xù)增大至300 cm×h-1，HSA動(dòng)態(tài)載量降至37.2 mg×mL-1，僅為線性流速100 cm×h-1時(shí)的62.9%。因此，采用IAA-CYS介質(zhì)從發(fā)酵液中分離rHSA，合適的上樣流速為100 cm×h-1。

圖4 IAA-CYS介質(zhì)對(duì)HSA的10%穿透動(dòng)態(tài)載量比較(pH 4.5)

圖5 IAA-CYS介質(zhì)對(duì)rHSA的穿透曲線(pH 4.5)

3.3 rHSA動(dòng)態(tài)載量

以畢赤酵母發(fā)酵處理液為料液，上樣pH為4.5，上樣流速為100 cm×h-1，考察了IAA-CYS介質(zhì)對(duì)rHSA的動(dòng)態(tài)載量。穿透曲線見(jiàn)圖5，10% 穿透的動(dòng)態(tài)載量為48.3 mg×mL-1，比純HSA降低了12.5%，可能是由于發(fā)酵液中部分雜質(zhì)影響了rHSA吸附。后續(xù)分離時(shí)，選取上樣量為動(dòng)態(tài)載量的80%，即38.6 mg×mL-1。比較發(fā)現(xiàn)，IAA-CYS介質(zhì)對(duì)rHSA的動(dòng)態(tài)載量高于Nuvia cPrime和TA-B-6FF介質(zhì)，接近Capto MMC介質(zhì)和MX-Trp-650M介質(zhì)。

圖6 不同洗脫pH和NaCl濃度下的rHSA純度

3.4 洗脫條件優(yōu)化

以畢赤酵母發(fā)酵處理液為料液，IAA-CYS介質(zhì)在pH為4.5條件下吸附rHSA，然后以不同pH和NaCl濃度的緩沖液洗脫，考察了pH和鹽濃度對(duì)rHSA洗脫的影響，不同洗脫條件的rHSA純度和收率見(jiàn)圖6和7。

比較rHSA純度發(fā)現(xiàn)，不添加NaCl，洗脫pH從5.0升高到8.0，rHSA純度逐步增大到64.5%；pH從8.0升高到9.0，rHSA純度減小為25.3%；相對(duì)而言，pH 8.0洗脫的rHSA純度最高。對(duì)于不同NaCl濃度(0～1.0 mol×L-1)，pH為8.0條件下洗脫的rHSA純度均為最高。在pH為8.0下，隨著NaCl濃度從0 升高到1 mol×L-1，rHSA純度先增大后降低。比較而言，合適的洗脫條件為pH為8.0、NaCl濃度為200 mmol×L-1，rHSA純度最高，達(dá)到76.1%。比較rHSA收率發(fā)現(xiàn)，在pH為5.0～9.0時(shí)，rHSA收率隨著NaCl濃度的升高而增大；NaCl濃度在0～1.0 mol×L-1時(shí)，隨著pH升高，rHSA收率先增大后減小，pH為8.0下的rHSA收率最大。比較而言，pH為8.0、NaCl濃度為200、400和600 mmol×L-1的rHSA收率較大，分別為88.1%、88.7% 和89.4%。

圖7 不同洗脫pH和NaCl濃度下的rHSA收率

綜合考慮，在pH為8.0、NaCl濃度為200 mmol×L-1下洗脫最合適，具有較高的rHSA純度和收率。

3.5 畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA

根據(jù)前文優(yōu)化結(jié)果，以畢赤酵母發(fā)酵處理液為料液，進(jìn)行了rHSA分離。上樣pH為4.5，上樣流速為100 cm×h-1，上樣量為38.6 mg×mL-1，洗脫條件為pH為8.0和NaCl濃度為200 mmol×L-1。

采用SDS-PAGE分析料液和洗脫液，發(fā)現(xiàn)料液的主要雜蛋白相對(duì)分子量約為45 000和36 000，前者可能是rHSA的降解片段。采用SEC-HPLC分析料液和洗脫液，結(jié)果見(jiàn)圖8。分析料液的SEC-HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)rHSA峰的洗脫時(shí)間為16.5 min，在主峰右邊有明顯的肩峰，與SDS-PAGE分析結(jié)果一致，可能是rHSA的降解片段；20～28 min洗脫時(shí)間的雜質(zhì)峰較大，主要是一些小分子雜質(zhì)。洗脫液的SEC-HPLC圖譜中未見(jiàn)明顯的小分子雜質(zhì)峰，rHSA收率為84.6%，純度為80.2%，經(jīng)IAA-CYS層析分離rHSA純度提高了19.3倍。采用ELISA分析了料液和洗脫液中的宿主細(xì)胞蛋白含量，分別為2 614.0和714.2 mg×kg-1，減小了72.7%。

為了進(jìn)一步提高rHSA純度，考慮在洗脫前添加淋洗步驟，以除去部分吸附的雜質(zhì)。系統(tǒng)比較了不同pH和NaCl濃度的洗脫條件，經(jīng)SEC-HPLC分析發(fā)現(xiàn)，pH為5.0、400 mmol×L-1的NaCl條件下的洗脫液中不含rHSA且小分子雜質(zhì)含量較高，是較好的淋洗條件。因此，采用前文相同的吸附和洗脫條件，洗脫前添加淋洗步驟，洗脫液的SEC-HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖8，rHSA收率為88.6%，純度提高到90.1%，洗脫液中的宿主細(xì)胞蛋白含量降為651.3 mg×kg-1。

圖8 SEC-HPLC分析

褚文寧等[18-19]考察了SP Sepharose FF、Nuvia cPrime、Capto MMC和MX-Trp-650M從畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA，發(fā)現(xiàn)SP Sepharose FF和Nuvia cPrime分離rHSA的純度均較低，僅82% 左右，且SP Sepharose FF分離需要對(duì)料液進(jìn)行稀釋預(yù)處理；采用Capto MMC和MX-Trp-650M分離效果較好，rHSA收率和純度均較高，大于95%，不過(guò)最佳上樣pH為4.0。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)pH為4.0時(shí)HSA分子呈快速遷移的F型結(jié)構(gòu)，與生理?xiàng)l件下的N型結(jié)構(gòu)有較大區(qū)別[6-8]。此外，采用Capto MMC分離，洗脫pH為 9.0，對(duì)HSA分子結(jié)構(gòu)也有一定程度影響[6-8]。吳啟賜等[20-21]采用TA-B-6FF從畢赤酵母發(fā)酵液中分離rHSA，rHSA單體純度達(dá)到87.8%，收率98.5%，不過(guò)介質(zhì)耐鹽性較差，對(duì)于酵母發(fā)酵液的吸附容量較低，上樣量?jī)H為7.2 mg×mL-1介質(zhì)。比較而言，本研究采用IAA-CYS介質(zhì)進(jìn)行分離，上樣pH為4.5，洗脫pH為8.0，有利于保持HSA的正常生理構(gòu)象，且每毫升介質(zhì)的上樣量達(dá)到38.6 mg。

總體來(lái)說(shuō)，IAA-CYS介質(zhì)用于從畢赤酵母發(fā)酵液分離rHSA，上樣和洗脫條件溫和，上樣量較大，耐鹽性好，料液不用稀釋預(yù)處理，且分離得到的rHSA純度和收率均較高。結(jié)果表明，IAA-CYS介質(zhì)具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

針對(duì)新型混合模式介質(zhì)IAA-CYS，探討了HSA吸附性能，優(yōu)化了吸附和洗脫條件，實(shí)現(xiàn)從畢赤酵母發(fā)酵液中高效分離rHSA。系統(tǒng)考察了pH和鹽對(duì)IAA-CYS介質(zhì)吸附HAS的影響，經(jīng)優(yōu)化，酵母發(fā)酵液中分離rHSA的最佳上樣條件為 pH 4.5，流速100 cm×h-1，每毫升介質(zhì)的rHSA上樣量為38.6 mg；淋洗條件為pH 5.0和400 mmol×L-1NaCl；洗脫條件為pH 8.0 和200 mmol×L-1NaCl，得到rHSA純度為90.1%，收率為88.6%。IAA-CYS介質(zhì)分離rHSA條件溫和，過(guò)程簡(jiǎn)便，應(yīng)用前景良好。

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Adsorption performance of a new resin for human serum albumin and recombinant human serum albumin purification

GE Cheng-tong, CHU Wen-ning, YAO Shan-jing, LIN Dong-qiang

(Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

In order to separate recombinant human serum albumin (rHSA) fromfermentation broth, HSA adsorption properties of a new resin IAA-CYS were studied and rHSA was separated from yeast broth after optimization. The adsorption of HSA with the IAA-CYS resin at different pH and salt concentrations was investigated. The results show that pH 4.5 is the best adsorption condition. Saturated adsorption capacity of HSA reached 157.6 mg×mL-1with little salt effects. The dynamic binding capacities of HSA under different NaCl concentrations and linear velocities were determined. The results indicate that velocity has great effect, and the suitable linear velocity is 100 cm×h-1. The salt concentration had little influence, and yeast broth could be directly loaded without dilution. The dynamic binding capacity of rHSA reached 48.3 mg×mL-1. The separation of rHSA from yeast broth was further optimized and optimum loading conditions were pH 4.5, velocity 100 cm×h-1and loading amount 38.6 mg×mL-1resin. After washing with 400 mmol×L-1NaCl at pH 5.0, rHSA was eluted with 200 mmol×L-1NaCl at pH 8.0. The purity of rHSA reached 90.1% while the yield was 88.6%. The results indicate that the separation conditions for rHSA separation with IAA-CYS resin are mild, and the fermentation broth does not need dilution due to good salt tolerance. The process developed is simple and efficient, which indicates that IAA-CYS has good application potential for rHSA separation.

human serum albumin; chromatography resin; adsorption performance; protein separation

Q 819

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.03.014

1003-9015(2021)03-0492-08

2020-05-08；

2020-05-28。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21476198，21776243)；國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)(2015DFG42070)。

葛程童(1995-)，男，浙江杭州人，浙江大學(xué)碩士生。

林東強(qiáng)，E-mail：lindq@zju.edu.cn