陳瓊 阮夢婷 常冉 張晴晴 蔣變玲 馮凡 徐禮生

摘 要：本實驗利用超聲波輔助提取大麥若葉青汁粉中的總多酚，將大麥若葉青汁粉多酚得率作為響應值，通過單因素實驗篩選出乙醇百分含量（EtOH%）、超聲功率（P）和超聲時間（T）三個主要因素，運用響應面法（RSM）對大麥若葉青汁粉總多酚的提取工藝進行優(yōu)化并通過單樣本t檢驗進行驗證。結果表明，大麥若葉青汁粉多酚提取方案最佳為選擇20：1液料比（RL/S）和61%乙醇，在70W超聲功率下提取32min，在該條件下大麥若葉青汁粉中多酚的得率實測值為12.04mg/g。模型預測值為11.92mg/g，通過單樣本t檢驗得，與實測值之間差異不顯著，說明響應面法可較好地優(yōu)化大麥若葉青汁粉總多酚的提取得率。

關鍵詞：大麥若葉;總多酚;響應面法;超聲助提

中圖分類號：TS207.3;O657 ?文獻標識碼：A ?文章編號：1673-260X（2021）05-0016-05

引言

大麥（Hordeum vulgare），亦稱赤膊麥、飯麥或牟麥，屬大麥屬禾本科，為一年生早熟草本植物[1]。大麥的芽和苗均可供藥用[2]。而大麥若葉是生長至15～30cm的大麥嫩葉通過一定加工工序制成的粉末，明代李時珍的《本草綱目》甚至早在唐代孫思邈的《普濟方》均曾記錄麥苗的功效[3]。而大麥若葉保健品始于20世紀六七十年代日本醫(yī)學博士荻原義秀的解毒經(jīng)歷和研究，隨后很快風靡亞洲和北美等地[4，5]，從而引發(fā)對大麥苗的重視和研究熱[6]。據(jù)文獻報道，大麥若葉具有范圍廣泛的食療功能，包括治療哮喘、胃病便秘、肝疾、糖尿病以及冠心病等，且其抑制腫瘤、抗氧化抗衰老、降血糖血脂、抗胃潰瘍和緩解疲勞的功能已有佐證[7，8]。

近來大麥苗中的多酚因其抗氧化性和抑制膽堿酯酶活性受到較多關注[9，10]。多酚類是植物次級代謝產(chǎn)物，藥理活性較為廣泛，如具有抗感染抗菌、抑癌、增強免疫、預防心血管疾病等活性[11]，以及消炎、抗增殖、抗衰老作用[12]。而關于大麥若葉青汁粉中總多酚提取的研究尚缺乏資料，目前植物多酚主要提取方式主要包括：傳統(tǒng)溶劑萃取、生物酶解提取、樹脂吸附提取、高壓脈沖提取、閃式提取、微波或超聲提取、超臨界提取等方法，其中前四種方法雖提取得率高，但提取所需時間較長且成本較高，不適用于大批量工業(yè)化生產(chǎn)[13];閃式提取法經(jīng)組織破碎后，因黏度增大、乳化等因素會造成過濾困難或堵塞[14];對于后三種方法，綜合向靜等[15]及包海蓉等[16]在多酚物質提取研究中發(fā)現(xiàn)，超聲提取更優(yōu)。綜上，鑒于超聲提取耗時短、效率高和成分不受高溫影響等方面的優(yōu)點[17]，本文利用超聲波輔助提取大麥若葉青汁粉多酚，考察EtOH%、RL/S、P和T四種因素對大麥若葉青汁粉多酚得率的影響，并利用RSM法對其提取工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥若葉青汁粉購于隨州市萬松堂康匯有限公司;沒食子酸（≥98%）購于中國藥品生物制品檢定所;福林酚試劑來自上海荔達科技公司。

紫外可見分光光度計（722N型）、超聲波清洗機（KQ5200DE型）分別來自上海元析儀器有限公司、昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多酚的測定

標準曲線（標曲）的繪制和樣品的測定參考胡明明等人方法[18]：本文標曲為A（吸光度）=0.0129C（沒食子酸濃度，μg/mL）-0.0311，R2=0.9989。

青汁粉中總多酚測定：將提取液于156×g離心力下離心15min后取上清并稀釋5倍為待測液。測定大麥若葉青汁粉多酚得率公式如下。

Y=（C×N×V）/M

式中Y：大麥若葉青汁粉多酚得率（BGTP）mg/g;C：從標曲中計算得到的多酚質量濃度，mg/mL;M：大麥若葉青汁粉質量，g;N：大麥若葉青汁粉稀釋倍數(shù);V：大麥若葉青汁粉提取液體積mL。

1.2.2 單因素實驗

精確稱取0.500g大麥若葉青汁粉，按表1工藝條件進行提取，分別考察乙醇百分含量（EtOH%）、液料比（RL/S）、超聲功率（P）和時間（T）對BGTP得率的影響。

1.2.3 響應面法優(yōu)化試驗設計

因液料比在20：1后不顯著影響總多酚的提取率，故不將料液比作為RSM法優(yōu)化的考慮因素。根據(jù)單因素實驗結果，確定總多酚提取的影響因素為T、P、EtOH%，設因素代碼分別為A、B、C，選取相應因素下總多酚提取率最高的三個水平（-1、0、1），以大麥若葉多酚得率為響應值，采用3因素3水平RSM分析法，選用Box-Benhnken實驗設計見表2。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

結果表示為“3次平行試驗的均值”±標準偏差，采用SPSS20.0進行單樣本t檢驗和差異性分析（p<0.01或者p<0.05），運用Design-Expert 8.06軟件進行RSM試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 EtOH%對大麥若葉青汁粉多酚得率的影響

由圖1可知，當EtOH%為60%時，青汁粉多酚得率最大，而后顯著降低（p<0.05）。推測在高濃度乙醇使大麥若葉青汁粉中的蛋白質產(chǎn)生變性，多糖發(fā)生凝集，阻礙部分與多糖或者蛋白質相結合的結合多酚的傳質，從而阻礙多酚的提取[19]。大麥若葉青汁粉中多酚極性與60%乙醇相接近，有利于多酚溶解，從而導致提取得率最大;乙醇濃度過大降低了溶劑體系的極性從而導致大麥若葉多酚的溶解度降低[20]。所以大麥若葉青汁粉多酚得率在60%乙醇體積分數(shù)下提取最優(yōu)。

2.1.2 P對得率的影響

由圖2，在功率70W時，大麥若葉青汁粉多酚達到最大，而后隨功率增加顯著降低。推測當功率超過70W時，多酚結構會被破壞，從而導致其得率降低[18]。所以超聲功率70W使得大麥若葉青汁粉總多酚得率最優(yōu)。

2.1.3 T對大麥若葉青汁粉多酚得率的影響

由圖3可知，大麥若葉青汁粉總多酚得率在超聲30min時最大;提取時間大于30min時，大麥若葉青汁粉總多酚得率顯著下降。推測為超聲時間過短，導致大麥若葉青汁粉中多酚物質沒有完全溶解到乙醇溶液中;而過長超聲時間可能會造成多酚物質被氧化破壞[21];或者溶液中其他物質析出，與多酚競爭溶劑或干擾檢測，降低了大麥若葉青汁粉總多酚得率;另一方面多酚結構在長時間的超聲剪切作用下遭到破壞而使提取率降低[22]。所以選擇超聲時間在30min左右。

2.1.4 液料比對大麥若葉青汁粉多酚得率的影響

由圖2，可知當液料比為10：1～20：1時，大麥若葉青汁粉中總多酚得率增加顯著;當液料比大于20：1時，其提取率變化不再顯著，故液料比不作為響應面優(yōu)化的因素。為節(jié)約試劑以及應用時企業(yè)降低成本，本文選擇液料比20：1。

2.2 響應面優(yōu)化提取條件結果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

根據(jù)單因素試驗結果，設定因素代碼A為乙醇百分含量（EtOH%）、B為超聲功率（P）、C為超聲時間（T）以及選取三個水平（-1、0、1），根據(jù)Box-Benhnken設計得到17組實驗方案，并據(jù)此進行提取分析，相關數(shù)據(jù)如表3。

2.2.2 模型的建立和方差分析

經(jīng)表4數(shù)據(jù)多元回歸分析，得到大麥若葉青汁粉中總多酚提取率（Y）與各因素EtOH%（A）、P（B）、T（C）之間回歸方程為Y=-211.709+2.775A+3.322B +1.403C+0.00707AB+0.00173AC–0.00187BC– 0.0274A2–0.0261B2–0.0218C2;模型的回歸系數(shù)R2=0.9807，擬合性良好，可用來分析和預測大麥若葉青汁粉多酚的提取條件。而信噪比（Adeq precisior）為15.154>>4，說明模型預測值和實際值擬合，模型適合指導工藝優(yōu)化。C、A2、B2、C2以及AB對青汁粉多酚得率影響見表4（*以及**分別表示因素對青汁粉提取率影響顯著和極顯著）。由F檢驗得，各因素影響大小順序為：C（T）>B（P）>A（EtOH%）。

2.2.3 各因素間交互作用分析

圖5為各因素交互作用對大麥若葉青汁粉多酚得率影響的響應面圖和等高線圖。響應曲面坡度越緩，說明因素對青汁粉提取得率的影響越低，反之越高;因素間交互作用越弱則等高線越近似圓形[23]。EtOH%和P因素間交互作用顯著，可直觀地由圖5（a）反映出。

2.3 響應面最優(yōu)條件優(yōu)化、預測和驗證

模型預測大麥若葉青汁粉總多酚的最佳提取方案為：T=31.57min，P=70.62W，EtOH=60.67%，而大麥若葉青汁粉多酚提取得率預測為11.92mg/g，為驗證響應面預測值的可靠性，將上述得到的最優(yōu)實驗數(shù)據(jù)組進行實驗驗證，為了操作的便捷，把實驗參數(shù)調整為超聲32min，功率70W，乙醇濃度61%，液料比為20：1，實際測得大麥若葉青汁粉總多酚得率為12.04mg/g，將實驗所得值與預測值進行單因素T檢驗，見表4。分析得出t為0.85，雙側Sig.值為0.49>0.05，兩組數(shù)據(jù)之間不存在顯著差異，說明響應面可以很好地預測大麥若葉青汁粉中總多酚得率。

3 結論

本選采用超聲輔助提取大麥若葉青汁粉中總多酚，用RSM法預測大麥若葉青汁粉多酚提取的最佳工藝條件，通過實驗驗證最佳工藝條件下大麥若葉青汁粉的多酚得率，結果表明，大麥若葉青汁粉最優(yōu)提取方案為選用乙醇61%，料液比20：1mL/g，在70W超聲功率下超聲32min，實際測得大麥若葉青汁粉總多酚為12.04mg/g，和預測值11.92之間無顯著差異。運用響應面法可有效地優(yōu)化超聲提取大麥若葉青汁粉總多酚，為大麥若葉青汁粉中多酚物質的利用提供了可靠的理論依據(jù)。

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