范蘭蘭，孔珊珊，吳彬彬，葉曉霞

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）是一種小分子量的短鏈脂肪酸，是一種被批準(zhǔn)用于治療小兒遺傳性尿素代謝障礙、鐮刀形細(xì)胞貧血和地中海貧血的臨床藥物[1-2]。2006年有研究報(bào)道PBA作為分子伴侶可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應(yīng)，重塑II型糖尿病鼠血糖穩(wěn)定[3]。近幾年研究表明，PBA可以通過抑制ERS反應(yīng)，減少氧糖剝奪后的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡[4]，減少原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的損傷[5]、減小骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)損傷[6]、減小腦組織缺血性損傷[7]、減少肝細(xì)胞損傷和凋亡[8]、治療II型糖尿病[9]、治療特發(fā)性肺纖維化或肺動(dòng)脈高壓[10]等。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PBA通過抑制GRP78的表達(dá)來緩解ERS，但是與正常細(xì)胞中的GRP78表達(dá)量相比仍然偏高。能否以PBA為模板，改造其結(jié)構(gòu)，尋找到比PBA作用更強(qiáng)的抑制劑呢？我們嘗試設(shè)計(jì)并合成了11個(gè)PBA類似物，并探討其對(duì)PC12細(xì)胞過度ERS的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器：中科牛津-Quantum-Iplus-400M核磁共振波譜儀（CDCl3或DMSO-d6作溶劑）；LTQ-Velos 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵；ZQJ-25手提紫外儀；BSA124S-CW電子天平；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器；XRS+凝膠成像系統(tǒng)；MX190酶標(biāo)儀；美國Thermo-6N98二氧化碳培養(yǎng)箱；ALLEGRA-64R低溫超速離心機(jī)。

1.1.2 試劑：PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤）來源于上海青旗生物科技有限公司，MTT試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；過氧化氫（H2O2，濃度為30%）、DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司；GRP78抗體、LC3抗體、GAPGH內(nèi)參、Marker試劑購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，乙酸乙酯、甲醇、石油醚、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）、3-甲基腺嘌呤、苯基丁酸等均購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；血清、雙抗、胰酶（含EDTA）以及DMEM培養(yǎng)基均購自中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 化合物A1-A5 的合成：稱取4-（氨基苯基）丁酸（1 g，5.61 mmol，1 eq）和三乙胺（1.3 mL，16.73 mmol，3 eq）加入至圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入4 mL二氯甲烷，緩慢滴入乙酰氯（1.2 mL，8.36 mmol，1.5 eq），反應(yīng)30 min，NaHCO3淬滅，經(jīng)萃取后將水層pH調(diào)至中性，干燥得化合物A1。將A1（0.824 g，3.61 mmol，1 eq）和K2CO3（0.990 g，7.23 mmol，2 eq）溶于DMF中，反應(yīng)30 min加入溴乙烷（815 μL，10.83 mmol，3 eq），萃取純化得A2。將A2（0.657 g，2.63 mmol，1 eq）溶于四氫呋喃中，加入NaH（0.189 g，7.91 mmol，3 eq）反應(yīng)30 min，再加入碘甲烷（141 μL，7.91 mmol，3 eq），萃取純化得A3。將A3（0.202 g，0.77 mmol，1 eq）溶于2 mL的CH3OH中，加入NaOH（57 μL，3.07 mmol，4 eq），油浴加熱120 ℃和80 ℃回流24 h，分別得到A4和A5（見圖1）

圖1 PBA類似物（A1-A5）合成路線及結(jié)構(gòu)

1.2.2 化合物A6-A9的合成：稱4-（氨基苯基）丁酸 （1 g，5.61 mmol，1 eq）于10 mL無水乙醇中溶解，滴加濃硫酸（891 μL，16.74 mmol，3 eq），油浴加熱70 ℃回流3 h，萃取純化得化合物A6。稱取A6（0.845 g，4.07 mmol，1 eq）于THF中溶解，加入NaH（0.294 g，12.23 mmol，3 eq）反應(yīng)30 min后，加入CH3I（761 μL，12.23 mmol，3 eq），萃取純化得化合物A7。稱取A7（0.757 g，3.42 mmol，1 eq）于DMF中攪拌溶解，加入K2CO3（1.514 g，10.26 mmol，3 eq）反應(yīng)30 min后加入CH3CH2Br （771 μL，10.26 mmol，3 eq）或CH3CH2CH2Br （970 μL，10.26 mmol，3 eq），得化合物A8或A9（見圖2）。

1.2.3 化合物A10-A11的合成：將A7（1 g，5.61 mmol，1 eq）于濃硫酸（2.409 mL，45.18 mmol，10 eq）中冰浴攪拌5 min后，滴加濃硝酸（2.034 mL，45.18 mmol，10 eq），反應(yīng)1.5 h后，冰水淬滅，萃取純化后分別得到化合物A10和A11（見圖3）。

1.2.4 PC12細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞生長(zhǎng)于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有熱滅活的10%胎牛血清和1%的抗生素（100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素）中，上述細(xì)胞均于37 ℃、含5% CO2的恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞快長(zhǎng)滿時(shí)進(jìn)行胰酶消化傳代，凍存于-80 ℃冰箱保種。

圖2 PBA類似物（A6-A9）合成路線及結(jié)構(gòu)

圖3 PBA類似物（A10-A11）合成路線及結(jié)構(gòu)

1.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞用0.25%含EDTA的胰酶消化，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基并加入藥物（10 μmol/L）孵育，藥物作用24 h后，在避光條件下，每孔加20 μL的MTT溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻5 min，并用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。存活率百分比計(jì)算公式如下：存活率= （OD給藥組-OD對(duì)照孔）/（OD溶劑組-OD對(duì)照孔）。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 MTT法測(cè)定H2O2引起自噬損傷的細(xì)胞生存率分析：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱孵育24 h，加入終濃度為10 μmol/L的藥物預(yù)保護(hù)18 h，再加入終濃度為 0.1 μmol/L的TG損傷24 h，避光條件下每孔加入 20 μL的MTT溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻 5 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。生存率= （OD給藥組-OD對(duì)照孔）/（OD溶劑組-OD對(duì)照孔）。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 MTT法測(cè)定TG引起ERS的細(xì)胞生存率分析：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱孵育24 h，加入終濃度為 10 μmol/L的藥物預(yù)保護(hù)18 h，再加入終濃度為 336 μmol/L的H2O2損傷24 h，避光條件下每孔加入20 μL的MTT溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，4 h后吸掉各孔MTT液并加100 μL的DMSO，震蕩均勻 5 min，并用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。生存率= （OD給藥組-OD對(duì)照孔）/（OD溶劑組-OD對(duì)照孔）。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 Western blot檢測(cè)ERS標(biāo)志蛋白和自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)：PC12細(xì)胞以每孔40萬接種于6孔板上，并在37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。加藥作用18 h后加雙氧水刺激24 h，在冰上用培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取試劑裂解細(xì)胞10 min。12 000 r/min 離心15 min后取上清液測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算出上樣量，等量蛋白樣品（80 μg）在10%或15% SDSPAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下用一抗過夜：GRP78抗體（sc-10789，1:1 000）、LC3 II/I抗體（sc-47724，1: 1 000）、Beclin-1（1:1 000）。用1×TBST洗滌3次后，在室溫下用兔二抗孵育1 h，蛋白條帶在ChemiDoc TMXRS+凝膠成像儀中來檢測(cè)蛋白表達(dá)，條帶灰度值用ImageJ軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物A1-A11的結(jié)構(gòu)解析

2.1.1 4-（4-(N-methylacetamido)phenyl） butanoic acid（A1）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：66.7%；IR（cm-1）：3335（N-H），2908（CH2），1712（O= C-OH），1633（O=C-N），1517，1540（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1410（C-N），1254（C-O）。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ 9.81（s，1H，-COOH），7.46（d，2H，Ar-H），7.08（d，2H，Ar-H），2.49（t，2H，Ar-CH2），2.18（t，2H，-CH2-C=O-OH），2.00（s，3H，CH3-C=O-NH），1.80～1.70（m，2H，-CH2）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 179.45（-O=C-OH），173.24（O=C-NH），142.43，141.31，133.63，124.36（Ar-C），39.03（Ph-C），38.25（-CH2-C=O-OH），31.54（-CH2），29.12（CH3- C=O-NH）。ESI-MSm/z：222.1[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.2 4-（4-(methylamino)phenyl）butanoic acid （A2）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：70.8%；IR（cm-1）：3361（N-H），2928（CH2），1717（O=C-O），1687（O=CN），1510（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1406（C-N），1174（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.56（s，1H，-NH），7.40（d，2H，Ar-H），7.10（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，-O-CH2），2.59（t，2H，Ar-CH2），2.29（t，2H，-CH2-C=O-OH），2.14（s，3H，CH3-C=O-NH），1.94～1.88（m，2H，-CH2），1.24（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.53（-O=C-OH），168.38（O=C-NH），137.43，135.99，128.91，120.14（Ar-C），60.27（-O-CH3），34.52（Ph-C），33.60（-CH2-C=O-OH），26.53（-CH2）24.42（CH3-C=O-NH），14.23（-CH3）。ESI-MSm/z：250.2[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.4 ethyl 4-（4-acetamidophenyl）butanoate （A4）：淡棕色油狀液體，產(chǎn)率：71.2%；IR（cm-1）：3288（N-H），2924（CH2），1700（C=O），1513，1447（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1212（C-O）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ 6.97（d，2H，Ar-H），6.59（d，2H，Ar-H），2.74（s，3H，N-CH3），2.55～2.49（t，2H，Ar-CH2），2.26（t，2H，-CH2-C=O），1.83（m，2H，-CH2）。13C NMR （125 MHz，CD3OD）δ 177.69（-O=C-OH），149.41，131.72，130.07，114.26（Ar-C），35.31（-N-CH3），34.34（Ph-C），31.34（-CH2-C=O-OH），28.27（-CH2）。ESI-MSm/z：194.1[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。2.1.5 4-（4-acetamidophenyl）butanoic acid （A5）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：50.7%；IR（cm-1）：2988（CH2），1715（O=C-OH），1684（O=C-N），1540，1508（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1457（C-N），1270（C-O）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ 7.30（d，2H，Ar-H），7.20（d，2H，Ar-H），3.22（s，3H，N-CH3），2.70（t，2H，Ar-CH2），2.32（t，2H，-CH2-C=O-OH），1.93（m，2H，-CH2），1.84（s，3H，CH3-C=O-NH）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ 177.13（-O=C-OH），173.13（O=C-NH），143.55，143.32，131.03，128.06（Ar-C），37.64 （-N-CH3），35.62（Ph-C），34.20（-CH2-C=O-OH），27.75（-CH2），22.29（CH3-C=O-NH）。ESI-MSm/z：236.1[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.6 ethyl 4-（4-aminophenyl）butanoate（A6）：黃褐色油狀液體，產(chǎn)率：85.4%；IR（cm-1）：3364（NH），2940（CH2），1722（C=O），1517，1448（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1176（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 6.99～6.93（d，2H，Ar-H），6.62（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），3.49（s，2H，-NH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.29（t，2H，-CH2-C=O），1.95～1.84（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13CNMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.64（-C=O），144.41，131.48，129.26，115.26（Ar-C），60.17（O-CH2），34.29（Ph-C），33.68（-CH2-C=O），26.86（-CH2），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：208.2[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.7 ethyl 4-（4-(methylamino)phenyl） butanoate（A7）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：83%；IR（cm-1）：3415（N-H），2941（CH2），1728（C=O），1520，1451（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1182（C-O）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ 7.04～6.97（d，2H，Ar-H），6.59～6.52（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），2.82（s，3H，-N-CH3），2.55（t，2H，Ar-CH2），2.30（t，2H，-CH2-C=O），1.95～1.86（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.67（-C=O），147.60，130.19，129.20，112.58（Ar-C），60.15（OCH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），30.97（N-CH3），26.92（-CH2），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：222.2 [M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.8 ethyl 4-（4-(ethylamino)phenyl）butanoate （A8）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：81.1%；IR（cm-1）：3401（N-H），2978（CH2），1731（C=O），1521，1483（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1183（C-O）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 6.99（d，2H，Ar-H），6.56（d，2H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），3.14（q，2H，-N-CH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.30（t，2H，-CH2-C=O），1.90（m，2H，-CH2），1.28～1.22（t，6H，-CH3）。13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ 173.67（-C=O），146.68，130.16，129.22，112.93（Ar-C），60.14（O-CH2），38.75（N-CH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），26.91（-CH2），14.94（-CH3），14.25（-CH3）。ESI-MSm/z：236.2[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.9 ethyl 4-（4-(propylamino)phenyl） butanoate（A9）：淡黃色油狀液體，產(chǎn)率：67.7%；IR（cm-1）：3411（N-H），2963（CH2），1732（C=O），1521，1480（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1183（C-O）。1H NMR （500 MHz，CDCl3）δ 6.99（d，2H，Ar-H），6.56（d，2H，Ar-H），4.13（q，2H，O-CH2），3.07（t，2H，-NCH2），2.54（t，2H，Ar-CH2），2.31（t，2H，-CH2-C=O），1.90（m，2H，-CH2），1.68～1.60（m，2H，-CH2），1.26（t，3H，-CH3），1.00（t，3H，-CH3）。13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ 173.69（-C=O），146.70，130.06，129.22，112.92（Ar-C），60.15（O-CH2），46.15（N-CH2），34.26（Ph-C），33.72（-CH2-C=O），26.92（-CH2），22.77（-CH2），14.26（-CH3），11.62（-CH3）。ESI-MSm/z：250.2[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.10 ethyl 4-（4-(methylamino)-2-nitrophenyl） butanoate（A10）：明黃色油狀液體，產(chǎn)率：45.3%；IR（cm-1）：3565（N-H），2928（CH2），1717（C=O），1540，1507（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1217（C-O）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）δ 7.08（d，2H，Ar-H），6.74（s，1H，Ar-H），4.12（q，2H，O-CH2），2.85（s，3H，-NCH3），2.81～2.74（t，2H，Ar-CH2），2.34（t，2H，-CH2-C=O），1.97-1.88（m，2H，-CH2），1.25（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 173.33（-C=O），150.04（Ar-C-NO2），148.26（Ar-C-NH），132.48，124.16，117.38，106.96（Ar-C），60.30（O-CH2），33.84（Ph-C），31.41（-CH2-C=O），30.55（N-CH3），26.05（-CH2），14.22（-CH3）。ESI-MSm/z：267.1 [M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.1.11 ethyl 4-（4-(methylamino)-3-nitrophenyl） butanoate（A11）：淡橙色油狀液體，產(chǎn)率：37.9%；IR（cm-1）：3583（N-H），2990（CH2），1728（C=O），1545，15077（苯環(huán)骨架振動(dòng)），1190（C-O）。1H NMR （500 MHz，CDCl3）δ 8.07（s，1H，Ar-H），7.81（d，1H，Ar-H），7.49（d，1H，Ar-H），4.15（q，2H，-OCH2），3.45（s，3H，-N-CH3），2.99～2.95（t，2H，Ar-CH2），2.41（t，2H，-CH2-C=O），2.05～1.99（m，2H，-CH2），1.26（t，3H，-CH3）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 172.93（-C=O），149.67（Ar-C-NH），141.31（Ar-C），134.90（Ar-C-NO2），133.18，122.47，114.34（Ar-C），60.49（O-CH2），33.71（Ph-C），31.78（-CH2-C=O），30.55（N-CH3），25.72（-CH2），14.22（-CH3）。ESI-MSm/z：267.1[M+H]+，與計(jì)算分子量吻合。

2.2 化合物A1-A11對(duì)細(xì)胞毒性的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，除化合物A11細(xì)胞存活率低于20%外，A1-A10的細(xì)胞存活率在100%左右，說明無細(xì)胞毒性。并且A1的細(xì)胞存活率高于100%，說明有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，且高于PBA組（P＜0.01），證明其具有較好的細(xì)胞保護(hù)作用。見圖4A。

2.3 化合物對(duì)TG誘導(dǎo)的ERS模型中PC12細(xì)胞存活率的影響 在TG誘導(dǎo)的ERS損傷模型中，TG組的生存率約為51%，而A1組的細(xì)胞生存率明顯高于TG組和PBA組（P＜0.05），但是A6卻顯示出了毒性，其余化合物在TG損傷模型中未見明顯毒性。見圖4B。

2.4 化合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的過度自噬模型PC12細(xì)胞存活率的影響 在H2O2誘導(dǎo)的過度自噬損傷模型中，化合物A1、A2、A4和A6-A10組的細(xì)胞生存率明顯高于H2O2組（P＜0.05），并且A1、A4、A6和A7組的細(xì)胞生存率高于PBA組，然而A2和A10組的細(xì)胞生存率低于PBA組（P＜0.05）。見圖4C。

根據(jù)以上MTT法檢測(cè)結(jié)果，綜合考慮化合物A1-A10對(duì)ERS和自噬損傷模型中細(xì)胞的雙重保護(hù)作用結(jié)果，我們選取化合物A1、A4、A8通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)ERS和自噬損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.5 化合物對(duì)ERS相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TG組GRP78蛋白表達(dá)量高于DMSO組，A1組GRP78蛋白表達(dá)量低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5A-B。

2.6 化合物對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3 II/I表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2組 Beclin-1和LC3 II/I蛋白表達(dá)量明顯高于DMSO組，A1組Beclin-1和LC3 II/I蛋白表達(dá)量低于H2O2組和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5C-E。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是一種具有重要生理功能的細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊、鈣的儲(chǔ)存和釋放，還參與脂類代謝、類固醇代謝等一系列過程，對(duì)維持心肌細(xì)胞Ca2+和蛋白質(zhì)合成穩(wěn)態(tài)具有重要作用[11-12]。缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等應(yīng)激刺激均可引起ER功能障礙，觸發(fā)ERS[13-15]。 適度的ERS有利于細(xì)胞內(nèi)鈣和蛋白質(zhì)加工等穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞耐受應(yīng)激剌激的能力；如果ERS持續(xù)存在或過強(qiáng)，細(xì)胞最終將啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。ER通路機(jī)制是近年來剛發(fā)現(xiàn)的一條新的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑，是目前研究熱點(diǎn)。研究表明，ER通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了多種常見疾病，如：神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ?、帕金森病等）、糖尿病、心腦組織缺血等的發(fā)病過程[16-19]，日益受到重視。

TG常作為ERS的誘導(dǎo)劑，我們選擇TG（0.1 μmol/L） 作為誘導(dǎo)劑，PBA（10 μmol/L）作為陽性對(duì)照藥，評(píng)估了化合物對(duì)TG誘導(dǎo)的ERS模型中損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞自噬是ERS狀態(tài)下產(chǎn)生的結(jié)果，與許多疾病密切相關(guān)，文獻(xiàn)報(bào)道，在腦缺血再灌注損傷中，存在過度ERS和過度自噬的雙重?fù)p傷病理生理過程，藥物通過抑制ERS和自噬途徑得以大大緩解腦損傷[20]。 因此，本研究同時(shí)探究了化合物A1-A10是否具有抑制過度自噬的作用。H2O2常被作為細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑[21]，當(dāng)H2O2在細(xì)胞內(nèi)含量過高時(shí)，則會(huì)引起細(xì)胞自噬和凋亡[22]。本研究選用H2O2（336 μmol/L）作為自噬的誘導(dǎo)劑，PBA（10 μmol/L）作為陽性對(duì)照藥。

GRP78是ERS重要的標(biāo)志性蛋白之一，抑制GRP78蛋白表達(dá)的上調(diào)，將會(huì)緩解過度ERS，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。LC3蛋白來源于自噬體，為自噬的標(biāo)志性蛋白，自噬發(fā)生時(shí)LC3 I會(huì)被Ag7蛋白活化成LC3 II，LC3 II和LC3 I的比值可用來衡量細(xì)胞自噬的水 平[23]，Beclin-1是自噬信號(hào)通路上的蛋白，也是檢測(cè)自噬水平的重要指標(biāo)，于是我們采用Western blot法檢測(cè)GRP78蛋白和Benclin-1、LC3 II/I蛋白的表達(dá)情況。

本研究結(jié)果表明化合物（除A11）均無顯著細(xì)胞毒性，并且A1細(xì)胞存活率優(yōu)于PBA，具有更好的細(xì)胞保護(hù)作用；采用MTT法分析化合物在TG誘導(dǎo)的ERS模型中對(duì)PC12細(xì)胞的生存率的影響，其中化合物A1對(duì)ERS損傷細(xì)胞具有明顯的保護(hù)活性，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)化合物A1、A2、A4和A6-A10對(duì)過度自噬損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且A1、A4、A6和A7對(duì)細(xì)胞的保護(hù)活性優(yōu)于PBA?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，本研究選擇A1、A4和A8通過Western blot法檢測(cè)上述化合物對(duì)ERS的標(biāo)志蛋白GRP78和過度自噬標(biāo)志蛋白LC3 II/I和Beclin-1的表達(dá)抑制量，進(jìn)一步證實(shí)設(shè)計(jì)合成的化合物對(duì)ERS和過度自噬的抑制作用；結(jié)果表明A1能抑制ERS標(biāo)志性蛋白GRP78的表達(dá)，具有對(duì)ERS抑制作用，且A1的抑制作用明顯優(yōu)于PBA，具備更好的對(duì)ERS導(dǎo)致的損傷細(xì)胞的保護(hù)作用；并且A1能抑制自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1以及LC3 II/I的表達(dá)，且A1的抑制作用明顯優(yōu)于3-MA，對(duì)過度自噬損傷細(xì)胞具有更好的保護(hù)作用。以上結(jié)果表明，設(shè)計(jì)合成的化合物A1母核PBA相比，對(duì)ERS和過度自噬損傷細(xì)胞具有更強(qiáng)的雙重保護(hù)作用。

圖5 Western blot法檢測(cè)GRP78蛋白和Benclin-1、LC3 II/I蛋白的表達(dá)情況

本研究合成了11個(gè)PBA類似物，并對(duì)其進(jìn)行了ERS和過度自噬的雙重抑制作用研究。首先參考文獻(xiàn)[24]，在PBA的苯環(huán)上引入了一個(gè)氨基，接著對(duì)氨基進(jìn)行了一系列簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)改造，將A1、A4結(jié)構(gòu)中的羧基乙酯化為A2、A7，A3結(jié)構(gòu)中的酯基水解為羧基得A5，從活性檢測(cè)結(jié)果表明，A1和A2，A4與A7，A3與A5之間活性相差無幾，說明結(jié)構(gòu)中為羧基還是酯基對(duì)活性影響不大；A6的游離氨基改造為甲氨基得A7，A7對(duì)ERS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷保護(hù)作用明顯加強(qiáng)，說明對(duì)氨基的結(jié)構(gòu)改造也許是活性改變的主要位點(diǎn)，A1活性最強(qiáng)，正是對(duì)游離氨基的乙?；?；鄰位硝基取代的A11對(duì)正常細(xì)胞PC12具有明顯毒性作用，細(xì)胞存活率下降明顯，我們推測(cè)可能是由于化合物中硝基的影響，然而，間位硝基取代的A10對(duì)正常細(xì)胞PC12無細(xì)胞毒性，且對(duì)ERS和過度自噬引起的損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用，說明硝基的取代位置對(duì)活性具有重要影響作用。

綜上所述，本研究設(shè)計(jì)合成的11個(gè)化合物，合成簡(jiǎn)便，通過對(duì)PBA簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)改造就獲得活性較其更強(qiáng)的化合物A1-A10，具有較其更好的ERS和過度自噬的雙重抑制作用，對(duì)ERS和過度自噬導(dǎo)致的損傷細(xì)胞起到保護(hù)作用，后續(xù)我們將對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。