王平，孟立平，劉龍斌，彭放

1.紹興市人民醫(yī)院（浙江大學(xué)紹興醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院（紹興市立醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary atherosclerotic heart disease，CHD）是嚴(yán)重危害人類生命健康的一種疾病，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前CHD的主要治療手段，但是冠脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）一直是心內(nèi)科介入醫(yī)師所面臨的一個(gè)非常棘手的問題。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層連續(xù)覆蓋于整個(gè)血管腔表面的扁平細(xì)胞，是血管基底膜的重要組成部分，是血管壁與血液間的分界細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞襯托在血管內(nèi)壁，具有許多重要的生理功能。完整的內(nèi)膜可以減少血栓的形成，減少平滑肌細(xì)胞的激活從而抑制ISR的形成。最近多項(xiàng)大規(guī)模臨床研究結(jié)果都顯示，雷帕霉素洗脫支架相比于其他的藥物洗脫支架，其支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加，有學(xué)者懷疑這可能跟雷帕霉素引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[4]，并通過基礎(chǔ)研究證實(shí)雷帕霉素可以影響內(nèi)皮細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加血小板和血栓黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上[5]。GUO等[6]研究結(jié)果顯示雷帕霉素在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)，也會(huì)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，甚至引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而破壞支架表面血管內(nèi)膜形成，增加支架內(nèi)血栓風(fēng)險(xiǎn)。這些研究結(jié)果提示在應(yīng)用雷帕霉素藥物洗脫支架的同時(shí)，使用血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)性藥物，可以減少支架內(nèi)血栓的形成，降低ISR的發(fā)生率。

在本研究中，我們通過隨訪雷帕霉素支架術(shù)后患者，根據(jù)復(fù)查造影結(jié)果確認(rèn)是否發(fā)生ISR，收集患者血漿并提取外泌體，用患者血漿外泌體干預(yù)經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制模型，觀察循環(huán)外泌體對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 內(nèi)皮細(xì)胞和主要試劑 本實(shí)驗(yàn)中采用的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC-12細(xì)胞）購自上海博湖細(xì)胞公司。胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Sigama公司；HOXA11-AS引物由上海吉?jiǎng)P生物科技公司合成，pHOXA11-AS及其相應(yīng)對照物購自上海吉?jiǎng)P生物科技公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑購自大連TaKaRa公司；CD63、CD9、PCNA、Ki-67、SOX4抗體均購自美國Sant Cruz公司，Western blot相關(guān)試劑購自蘇州碧云天生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首先探索循環(huán)外泌體對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響，使用雷帕霉素制作內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制模型，將細(xì)胞分為對照組、雷帕霉素組（使用雷帕霉素干預(yù)）、雷帕霉素+對照外泌體組（在雷帕霉素干預(yù)的基礎(chǔ)上，加入對照組患者血漿外泌體）、雷帕霉素+ISR外泌體組（在雷帕霉素干預(yù)的基礎(chǔ)上，加入ISR組患者血漿外泌體）。之后探索lncRNA HOXA11-AS對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響，使用雷帕霉素制作內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制模型，將細(xì)胞分為雷帕霉素組（使用雷帕霉素干預(yù)），雷帕霉素+pHOXA11-AS（在雷帕霉素干預(yù)的基礎(chǔ)上，加入pHOXA11-AS），雷帕霉素+pNS組（在雷帕霉素干預(yù)的基礎(chǔ)上，加入空質(zhì)粒）。

1.3 血漿外泌體的提取及鑒定 收集隨訪2018年6月至2020年6月紹興市人民醫(yī)院及紹興市立醫(yī)院收治的單支血管病變并植入1枚雷帕霉素支架的患者共426例，有隨訪造影結(jié)果的231例，根據(jù)是否發(fā)生ISR，將患者分為對照組（199例）和ISR組（32例），兩組患者基本臨床資料及病變特征見表1。收集兩組患者的血液，離心獲得血漿后馬上用美國Life公司的Invitrogen外泌體提取試劑盒提取血漿中的外泌體，并在-80 ℃冰箱保存。本研究中所有患者均簽署知情同意書，并由紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。將所提取的外泌體先后經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，再經(jīng)脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，制成60 nm超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色，在HITACH500透射電鏡（日本日立公司）上觀察血漿外泌體的形態(tài)。血漿外泌體濃度和大小分布的測試使用q Nano（S/N 601A 1405 0338）和納米孔NP100（A38350）。

表1 兩組患者基本臨床資料及病變特征

1.4 Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD9和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、Ki67、SOX4的表達(dá)情況提取外泌體，加入500 μL蛋白裂解液離心去上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經(jīng)電泳蛋白分離和轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，經(jīng)Quantity One進(jìn)行灰度測量分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞增殖能力 取4～7代細(xì)胞，胰酶消化后以每孔6×103個(gè)接種于96孔板中。細(xì)胞貼壁后，饑餓24 h使細(xì)胞同步化。各組細(xì)胞加入相應(yīng)的循環(huán)外泌體或者pHOXA11-AS等干預(yù)因素，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，2個(gè)空白對照孔。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)6、12、24、48 h后，每孔加入20 μL MTT液，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，96孔板震蕩10 min，在490 nm波長處用酶標(biāo)儀測定各孔OD值。最后以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 RT-PCR檢測外泌體中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS的表達(dá)水平 將提取的循環(huán)外泌體送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司檢測進(jìn)行非編碼RNA芯片分析，得到表達(dá)差異的非編碼RNA。TRIzol法提取各組細(xì)胞中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。lncRNA HOXA11-AS引物上游：5’-TGCCAAGTTGTACTTAC TACGTC-3’，下游：5’-GTTGGAGGAGTAGGAGTATGTA-3’；以β-actin作為內(nèi)參，引物上游：5’-GCACCACACCTTCT ACAATGAGC-3’，下游：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA C-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，15 s，退火60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，結(jié)果以2-△△Ct方法分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS.20.0和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體分離及鑒定 提取兩組患者的血漿外泌體后，電鏡結(jié)果顯示外泌體呈現(xiàn)典型的茶托樣結(jié)構(gòu)（見圖1A）；q Nano分析結(jié)果顯示所提取的外泌體主要集中在20～100 nm（見圖1B）；Western blot結(jié)果顯示，相比于血清，我們所提取的外泌體中CD63、CD9這兩個(gè)外泌體標(biāo)志蛋白均有明顯的表達(dá)（見圖1C）。上述結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的提取了患者血漿中的外泌體。

圖1 血漿外泌體的鑒定

2.2 外泌體抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖 用所提取的ISR患者和對照組患者的血漿外泌體，分別干預(yù)經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。熒光顯微鏡下顯示兩組患者中提取的血漿外泌體都可以進(jìn)入細(xì)胞，將外泌體中的物質(zhì)帶入內(nèi)皮細(xì)胞中（見圖2A）。MTT結(jié)果顯示，相比于對照組，雷帕霉素組細(xì)胞增殖能力減弱（P＜0.05）；相比于雷帕霉素組，對照組外泌體干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增加（P＜0.05）；而ISR組外泌體無此作用（見圖2B）；Western blot結(jié)果顯示，相比于對照組，雷帕霉素組細(xì)胞中PCNA和ki-67表達(dá)減少（P＜0.05）；相比于雷帕霉素組，對照組外泌體干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞中PCNA和ki-67表達(dá)增加（P＜0.05），見圖2C-D。

2.3 外泌體中差異表達(dá)非編碼RNA的篩選 非編碼RNA芯片分析結(jié)果顯示，與對照組比，ISR組患者血漿外泌體中多種lncRNA的表達(dá)發(fā)生了變化，其中最明顯的是lncRNA HOXA11-AS（見圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一芯片檢測結(jié)果，采用RT-PCR法檢測了31例對照患者（從199例中隨機(jī)抽?。┖?2例ISR患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，ISR患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS的表達(dá)明顯減少（t=2.71，P＜0.05），見圖3B。

圖2 對照組患者血漿外泌體降低雷帕霉素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用

2.4 lncRNA HOXA11-AS促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖 用lncRNA HOXA11-AS干預(yù)經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制模型，MTT結(jié)果顯示，相比于雷帕霉素組，雷帕霉素+pHOXA11-AS組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示，相比于雷帕霉素組，雷帕霉素+pHOXA11-AS組細(xì)胞中PCNA、Ki-67表達(dá)增加（P＜0.05），同時(shí)，SOX4的表達(dá)增加（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

外泌體是由細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的生物活性微泡，其直徑一般為40～100 nm，高表達(dá)CD63、CD81、TSG101等分子。血液中的外泌體不僅參與了多種疾病的進(jìn)展，在維持機(jī)體正常的生理平衡過程中也有重要作用。RIBEIRO-RODRIGUES等[7]研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞分泌的外泌體具有保護(hù)缺血心肌，促進(jìn)新生血管形成的作用。GALLET等[8]研究發(fā)現(xiàn)部分心梗患者血漿中提取的外泌體具有減少心臟瘢痕，阻止心肌重構(gòu)的作用。本研究提取了植入雷帕霉素藥物洗脫支架后發(fā)生ISR和沒有發(fā)生ISR的患者血漿外泌體，并用這些外泌體干預(yù)經(jīng)雷帕霉素處理之后的內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)相較于ISR組，對照組干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果提示ISR患者和無ISR患者血漿外泌體有差異，并且血漿外泌體可能是通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力而參與了ISR的形成。

外泌體主要是通過包裹在里面的蛋白質(zhì)、microRNA和lncRNA等小分子發(fā)揮生物學(xué)功能。 lncRNA雖然不直接參與編碼蛋白質(zhì)，但是其參與調(diào)控機(jī)體生命進(jìn)程中一系列重要過程，包括生長發(fā)育、器官形成、骨髓造血、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等[9]。 在心血管領(lǐng)域中，lncRNA在CHD、高血壓、心臟功能不全等疾病的發(fā)生發(fā)展中都具有重要的調(diào)控作用。BALLANTYNE等[9]研究發(fā)現(xiàn)lnc-SMILR在動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊和血漿中的表達(dá)增加，并可以通過促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移從而加速粥樣斑塊的進(jìn)展?；谶@些研究結(jié)果，我們猜測在ISR過程中血漿外泌體可能也是通過其中的lncRNA發(fā)揮作用。本研究通過基因芯片技術(shù)檢測了雷帕霉素藥物洗脫支架植入術(shù)后發(fā)生ISR以及沒有發(fā)生ISR患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)7種lncRNA在兩組之間表達(dá)差異明顯，ISR組中MAGI2-AS3、lincRNAp21、LOC645166表達(dá)增加，ZNF37BP、LOC389906、LINC00189、lncRNA HOXA11-AS表達(dá)減少。為了進(jìn)一步篩選，我們用RT-PCR法檢測了目前已經(jīng)收集了的雷帕霉素藥物洗脫支架植入后的32例ISR以及31例對照組患者血漿中上述lncRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lnc HOXA11-AS在ISR患者血漿外泌體中表達(dá)減少。HOXALL-AS是一個(gè)新近被發(fā)現(xiàn)并研究的lncRNA，關(guān)于此lncRNA的報(bào)道主要集中在腫瘤領(lǐng)域。有研 究[13]發(fā)現(xiàn)HOXA11-AS與膠質(zhì)瘤的細(xì)胞周期相關(guān)，能反映腫瘤的分級(jí)，并導(dǎo)致不良的預(yù)后。而有研究則提出HOXA11-AS可能通過作用于HOXA11-AS基因來參與宮頸癌的發(fā)生[14]。國外的研究報(bào)道了HOXA11-AS的表達(dá)差異與人卵巢癌及肺腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲、分期及預(yù)后等因素相關(guān)，并提出HOXA11-AS對卵巢癌的抑制并非是通過對HOXA11基因的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的[15-16]。有研究顯示HOXA11-AS可以通過調(diào)控miR-140-5p、LATS1、miR-124、PADI2等的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[17-21]。上述研究均提示HOXA11-AS具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，與上述研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果顯示HOXA11-AS可緩解雷帕霉素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的抑制作用。文獻(xiàn)資料表明HOXA11-AS可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖[17-21]，目前尚未見HOXA11-AS對細(xì)胞的抑制作用的相關(guān)報(bào)道，可能HOXA11-AS是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子，所以在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的同時(shí)，同樣也會(huì)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖，從而降低雷帕霉素對平滑肌細(xì)胞的抑制作用，成為促進(jìn)ISR進(jìn)展的一個(gè)因子，我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證HOXA11-AS對平滑肌細(xì)胞增殖能力的作用。

圖3 ISR患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS的表達(dá)明顯減少

SOX4基因?qū)儆赟OX C亞族，主要在胚胎發(fā)育過程中的心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胸腺高表達(dá)。此外，SOX4還在一些干細(xì)胞和祖細(xì)胞中高表達(dá)，對干細(xì)胞的穩(wěn)定和分化具有重要的調(diào)控作用。研究表明SOX4基因突變、缺失或者過表達(dá)不僅會(huì)引起先天性疾病，還與腫瘤、心腦血管疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)SOX4基因的表達(dá)與多種腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，并預(yù)測SOX4可以作為腫瘤治療的一個(gè)靶向位點(diǎn)[22-23]。此外，靶向抑制SOX4的表達(dá)可以降低細(xì)胞的增殖能力[24-25]。為了進(jìn)一步探究血漿外泌體抗ISR效應(yīng)的機(jī)制以及HOXA11-AS在其中的作用，我們通過靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)lncRNA HOXA11-AS與SOX4具有可能結(jié)合的相應(yīng)位點(diǎn)，并通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA HOXA11-AS可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中SOX4的表達(dá)，所以我們推測，血漿外泌體中的lncRNA HOXA11-AS可能是通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中SOX4的表達(dá)，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力。

本研究成功收集并分離出ISR及對照組患者血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)對照組患者外泌體可以降低雷帕霉素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，并通過基因芯片及RT-PCR篩選出兩組外泌體之間lncRNA HOXA11-AS表達(dá)差異。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)lncRNA HOXA11-AS可以降低雷帕霉素對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，并同時(shí)促進(jìn)SOX4表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測血漿外泌體中的lncRNA HOXA11-AS可能是通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中SOX4的表達(dá)，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力。

A：MTT法測細(xì)胞增殖能力；B：Western blot檢測增殖標(biāo)志蛋白PCNA和Ki-67的表達(dá)情況；C：Western blot檢測SOX4的表達(dá)情況。與雷帕霉素組比：aP＜0.05 圖4 lncRNA HOXA11-AS促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖