禹玉婷，胡崗，羅志宇，盧佳，王澤鋆，孟勝利，申碩

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430070

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由多種腸道病毒感染引起的一種病毒性疾病。HFMD在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)多次暴發(fā)流行，以夏秋季常見?；颊咧饕獮閷W(xué)齡前兒童，尤以3歲以下年齡組發(fā)病率最高，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜、手足等多處皰疹，少數(shù)可引起腦炎、肺水腫、弛緩性麻痹、心肌炎和心臟衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡［1］。

引起HFMD的腸道病毒至少有20多個(gè)型，包括柯薩奇病毒A組（Coxsackievirus A，CV-A）的2、4、5、6、10、12和16型，柯薩奇病毒B組（Coxsackievirus B，CVB）的5個(gè)型，埃可病毒（Echovirus，Echo），腸道病毒71型（enterovirus 71，EV-A71）。CV-A2于1947年在美國(guó)特拉華首次分離得到原型株Fleetwood［2］，基因結(jié)構(gòu)分為5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)及位于非編碼區(qū)之間的開放閱讀框架。其編碼區(qū)包含編碼結(jié)構(gòu)蛋白的P1區(qū)和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的P2、P3區(qū)。P1區(qū)編碼4種衣殼蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接外，其他3種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面；P2和P3區(qū)編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白2APro、2BPro、2CPro、3APro、3BPro、3CPro和3DPro，與病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、病毒多聚蛋白的剪切、病毒顆粒的裝配等功能相關(guān)。細(xì)胞表達(dá)的重組多聚蛋白P1被同時(shí)表達(dá)的3CDproC酶剪切為VP0、VP1和V-A4，裝配為成分與病毒感染后的前顆粒（procapsid）相似的病毒樣顆粒（viruslike particles，VLPs）。CV-A2主要引起皰疹性咽峽炎、腦炎、脊髓炎、心肌炎、心包炎、流行性胸痛、呼吸道感染、HFMD、嬰兒腹瀉等，引起暴發(fā)流行［3-7］。2008年中國(guó)臺(tái)灣腸道病毒流行時(shí)，在221份采集樣品中，73%（161／221例）為皰疹性咽峽炎，27%（60／221例）為HFMD［8］。2012年瑞典腸道病毒早期感染的隨訪中，CV-A2感染比例占9.6%，僅次于CV-A9（13.5%）和CV-A16（11.5%）［9］。CV-A2感染引起的疾病多數(shù)癥狀較輕、病程較短，且較少出現(xiàn)并發(fā)癥或留下后遺癥［10-12］。但也出現(xiàn)因感染CV-A2引起手足口重癥并導(dǎo)致死亡的報(bào)道［13］：2012年6月10日，中國(guó)香港1位健康的4歲男童出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽和鼻漏，入院后4 h死亡。同年6月19日，中國(guó)香港1名2個(gè)月大女童，上呼吸道感染持續(xù)3 d，入院后1 h死亡。兩名患兒的尸檢結(jié)果均顯示CV-A2感染呈陽性，且分離株為CV-A2與EV-71和CV-A4的重組株。本實(shí)驗(yàn)室于2016年10月至2017年12月在湖北省襄陽市進(jìn)行的HFMD病原學(xué)研究表明，CV-A2可引起HFMD暴發(fā)流行，且與CV-A5、CV-A6、CV-A10、CV-A16和EV-A71共同流行，成為HFMD的主要病原體之一；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CV-A2也可引起重癥病例［14］。因此，對(duì)這種血清型腸道病毒的監(jiān)測(cè)和基礎(chǔ)研究具有非常重要的意義和實(shí)用價(jià)值。

目前，預(yù)防HFMD的主要候選疫苗為細(xì)胞基質(zhì)全病毒滅活疫苗和VLPs疫苗。然而，滅活疫苗中除EV-A71和CV-A16外，其他主要血清型病毒較難在人用疫苗基質(zhì)細(xì)胞中生長(zhǎng)。VLPs具有產(chǎn)量大、易富集和易純化的特點(diǎn)，也使得其逐漸廣泛應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域。因此，探索桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，純化CV-A2 VLPs，具有重要的應(yīng)用意義，可為CV-A2及多價(jià)HFMD疫苗的研制提供參考。本研究構(gòu)建了CV-A2 P1-3CD重組Bacmid質(zhì)粒，并表達(dá)了rCV-A2 VLPs，為今后rCV-A2 VLPs疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞 pFastBacDual穿梭質(zhì)粒、Sf9細(xì)胞、人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD）由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司保存，E.coli DH10 BacTM感受態(tài)細(xì)胞由該公司病毒疫苗研究一室制備并保存。

1.2 主要試劑及儀器 RNA抽提純化試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA marker購 自 日 本TaKaRa公司；Sf900Ⅲ培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；CellfectionⅡReagent和羊抗兔Alexa-488多抗購自美國(guó)Invitrogen公司；AxyPrep plasmid miniprep kit購自美國(guó)Axygen公司；蛋白質(zhì)marker及BamHⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ和SphⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國(guó)Thermo Fisher公司；抗CV-A5 VLP兔多抗由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；抗CV-A5 VP1兔多抗、抗CV-A5 VP2兔多抗、抗CV-A5 VP3兔多抗和抗CV-A5 FP兔多抗由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒疫苗研究一室制備；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）購自美國(guó)Boster公司；凝膠成像系統(tǒng)儀購自芬蘭BioTop公司；30 kD超濾濃縮膜包購自美國(guó)Millipore公司。

1.3 CV-A2 P1-3CD重組Bac m i d的構(gòu)建

1.3.1 P1和3CD基因序列的確定 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室于2016年10月至2017年12月從湖北省襄陽市HFMD患者中收集臨床樣本，并在人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD）中分離得到CV-A2-1580R4／CHN XY／2017株。提取病毒RNA，利用Oligo dT／Random引物（Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，加入設(shè)計(jì)的全基因組測(cè)序引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR反應(yīng)體系：PremixLA Taq 10μL，F(xiàn)orward Prime（r20μmol／L）1μL，Reverse Prime（r20μmol／L）1μL，cDNA product（≥50 ng／μL）0.5μL，H2O 7.5μL，總體積20μL。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃1 min，共30~35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。與CV-A2原型株Fleetwood株（GenBank：AY421760.1）進(jìn)行比對(duì)，確定P1和3CD序列。

1.3.2 重組質(zhì)粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD的構(gòu)建 依據(jù)昆蟲細(xì)胞偏好特性優(yōu)化密碼子并合成P1和3CD cDNA基因，通過T-A克隆，將P1和3CD片段連接至pFastBacDual載體上，將2個(gè)基因片段，分別置于多角體蛋白啟動(dòng)子pPh和pP10啟動(dòng)子后，以上操作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將得到的重組質(zhì)粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD分別進(jìn)行BamHⅠ／SpeⅠ和XhoⅠ／SphⅠ雙酶切鑒定。

1.3.3 CV-A2P1-3CD Bacmid重組 將pFastBac Dual CV-A2 P1-3CD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10 BacTM感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72 h，獲得CV-A2 P1-3CD重組Bacmid。利用引物對(duì)CV-A2 P1-3CD重組Bacmid進(jìn)行鑒定，引物序列見表1，其中，擴(kuò)增M13F／M13R片段（7016bp）的正反向引物分別為M13F和M13R，擴(kuò)增P1片段（3 112 bp）的正反向引物分別為M13F和CV-A2-P1，擴(kuò)增3CD（3 586 bp）片段的正反向引物分別為CVA2-3CD和M13R。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖液15.2μL，DNA模板0.4μL，Taq酶混合物3.6μL，正反向引物各0.8μL（1.0 ng／μL），補(bǔ)加ddH2O至20μL。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。將CV-A2 P1-3CD重組Bacmid感染Sf9細(xì)胞96 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.4 重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD的構(gòu)建及DNA鑒定 按照Cellfection?Reagent說明書進(jìn)行操作。將CV-A2 P1-3CD重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，于生化培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變，獲得重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD。提取病毒DNA，利用M13F／M13R和M13R／CV-A2-3CD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)插入的DNA序列進(jìn)行鑒定。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.3.3項(xiàng)。

1.4.2 IFA試驗(yàn) 對(duì)重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD進(jìn)行鑒定。將病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9 72 h后，用4%多聚甲醛固定，5%BSA+0.5%TritonX-100+PBS室溫封閉；加入兔抗CV-A2 VLP多抗（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；加入羊抗鼠Alexa-488（1∶2 000稀釋），37℃孵育1 h；熒光顯微鏡下觀察。

1.5 r CV-A2 V L Ps的純化及鑒定

1.5.1 蔗糖墊底及氯化銫密度梯度離心 收集rCVA2 VLPs感染的Sf9細(xì)胞，反復(fù)凍融后離心去細(xì)胞碎片，上清經(jīng)孔徑為30 kD的膜包超濾濃縮，濃縮產(chǎn)物經(jīng)20%蔗糖，15 000×g墊底離心4 h，1.31 g／mL CsCl密度25 000×g離心20 h，抽取目標(biāo)條帶。

1.5.2 SDS-PAGE及Westernblot鑒定 將純化后的rCV-A2 VLPs分別經(jīng)0.1%SDS-12.5%PAGE和Western blot鑒定。Western blot：以抗CV-A2 VLP多抗（1∶2 000稀釋）為一抗，4℃孵育過夜；以羊抗鼠多抗（1∶5 000稀釋）為二抗，37℃孵育1 h；最后用DAB顯色系統(tǒng)顯色。

1.5.3 透射電鏡觀察 取樣品100μL，與銅網(wǎng)有支持膜的表面接觸，靜置3 min，用3%磷鎢酸負(fù)染5 min，常溫過夜晾干，送中國(guó)科學(xué)院武漢病毒所進(jìn)行電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 P1和3CD基因序列 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定，可見清晰的目的條帶，見圖1。利用SeqMan（7.1.0）軟件拼接測(cè)序結(jié)果，獲得CV-A2-1580R4／CHNXY／2017株基因組全序列。序列全長(zhǎng)7 401 bp，非編碼區(qū)5′-UTR、3′-UTR在基因組的核苷酸位置分別為1~747 bp和7 321~7 401 bp，3′-UTR后帶長(zhǎng)度未確定的多聚A尾，編碼的多聚蛋白（Poly-protein）長(zhǎng)度為2 191個(gè)氨基酸殘基。P1序列位置為748~3 324 bp，3CD序列位置為5 383~7 317 bp。

圖1 CV-A2部分序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of partial CV-A2 gene sequences

2.2 重組質(zhì)粒pF astBacD u a l CV-A2 P1-3CD的鑒定質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在2 587和1 948 bp處可見特異性條帶，大小與合成的CV-A2 P1和CV-A2 3CD片段一致，見圖2。

圖2 CV-A2 P1（A）和CV-A2 3CD（B）基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile of PCR products of CV-A2 P1（A）and CV-A2 3CD（B）genes

2.3 CV-A2P1-3CD重組Bac m i d的鑒定1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在7 016、3 112和3 586 bp處可見特異性條帶，大小分別與M13F／M13R、P1和3CD相符，見圖3，表明CV-A2 P1-3CD基因成功轉(zhuǎn)座至Bacmid。CV-A2 P1-3CD重組Bacmid感染Sf9細(xì)胞96 h后，細(xì)胞裂解破碎、脫落，見圖4。

圖3 CV-A2 P1-3CD重組Bacmid的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant Bacmid with pFastBac-Dual-CV-A2 P1-3CD by PCR

圖4 CV-A2 P1-3CD重組Bacmid感染Sf9細(xì)胞的顯微鏡觀察（×200）Fig.4 Microscopy of Sf9 cells infected by recombinant Bacmid with CV-A2 P1-3CD（×200）

2.4 重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在7 016和3 586 bp處可見特異性條帶，大小分別與M13F／M13R和M13R／CV-A2-3CD引物擴(kuò)增條帶相符，見圖5，重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD感染成功，獲得目的rCV-A2 VLPs。

圖5 重組桿狀病毒rBac-CV-A2 P1-3CD的PCR鑒定Fig.5 Identification of rBac-CV-A2 P1-3CD by PCR

2.5 r CV-A2 P1-3C D蛋白的I FA鑒定 rCV-A2 P1-3CD蛋白可與多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，其感染細(xì)胞可檢測(cè)到綠色熒光，而未感染細(xì)胞無熒光信號(hào)，見圖6，表明rCV-A2 VLPs蛋白成功表達(dá)。

圖6 Sf9細(xì)胞表達(dá)rCV-A2 VLPs的IFA檢測(cè)（×200）Fig.6 IFA of rCV-A2 VLPs expressed in Sf9 cells（×200）

2.6 純化的r CV-A2 V L Ps的鑒定

2.6.1 CsCl密度梯度離心 感染rCV-A2 VLPs的Sf9細(xì)胞上清經(jīng)蔗糖墊底離心和CsCl密度梯度離心后，可見明顯條帶，中間條帶為目的產(chǎn)物。見圖7。

圖7 CsCl密度梯度離心純化rCV-A2 VLPsFig.7 Purification of rCV-A2 VLPs by cesium chloride density gradient centrifugation

2.6.2 SDS-PAGE及Westernblot rCV-A2VLPs經(jīng)SDSPAGE和Western blot分析，均可見清晰的VP0（相對(duì)分子質(zhì)量約39 000）、VP1（相對(duì)分子質(zhì)量約34 000）和VP3（相對(duì)分子質(zhì)量約27 000）條帶，見圖8。

圖8 rCV-A2 VLPs蛋白的SDS-PAGE（A）及Western blot（B）鑒定Fig.8 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profilesof rCVA2 VLPs

2.6.3 透射電鏡觀察 病毒顆粒分布均勻，形狀規(guī)則，直徑23~33 nm，形態(tài)和大小與腸道病毒CV-A2一致，見圖9。

圖9 純化rCV-A2 VLPs的電鏡觀察（×200）Fig.9 Electron microscopy of purified rCV-A2 VLPs（×200）

3 討論

本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pFastBacDualCVA2 P1-3CD，轉(zhuǎn)化DH10 BacTM感受態(tài)細(xì)胞，獲得CVA2 P1-3CD重組Bacmid，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后能夠表達(dá)VLPs，表達(dá)的蛋白能與rCV-A2 VLPs多抗結(jié)合，且相對(duì)分子質(zhì)量大小與CV-A2 VP0、VP1和VP3相符。透射電鏡觀察顯示，表達(dá)的VLPs與CV-A2的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，表明rCV-A2 VLPs制備成功。

VLPs是含有病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，無病毒核酸，不能自主復(fù)制，其在病毒結(jié)構(gòu)上與天然病毒粒子相同或者相似，可通過與病毒感染相似的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效地誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此是理想的診斷試劑或者疫苗抗原。桿狀病毒的多角體蛋白在病毒復(fù)制的晚期大量合成，早在上世紀(jì)80年代就有科學(xué)家提出使用外源基因代替多角體編碼序列，進(jìn)而表達(dá)外源蛋白的設(shè)想［15］。1983年，SMITH等［16］首次報(bào)道了使用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得人β干擾素，使得這種設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。桿狀病毒具有基因容量大、啟動(dòng)子強(qiáng)、目的基因真核表達(dá)、不感染人等特點(diǎn)［17］，這些特性使得利用桿狀病毒表達(dá)的基因遍及病毒、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物及植物等各種生物群，該表達(dá)系統(tǒng)也成為當(dāng)前應(yīng)用最廣、功能最全的真核表達(dá)系統(tǒng)。另外現(xiàn)在有很多桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化策略相繼提出，有的已經(jīng)成功的商品化。如在桿狀病毒基因組的改造方面，出現(xiàn)了第2代桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)FlashBAC系列，該系列系統(tǒng)缺失了桿狀病毒基因組DNA必需基因的一部分，用一段人工合成的基因（bacterial artificial chromosome，BAC）替代多角體編碼區(qū)，該系統(tǒng)中刪除chiA基因的flashBAC載體、chiA和V-cath基因的flashBAC-GOLD載體和chiA、V-cathp、p10、p74和p26基因的flashBAC-ULTRA載體，均能明顯提高蛋白表達(dá)量。另外，在昆蟲細(xì)胞系的改造方面，在Sf9細(xì)胞基礎(chǔ)上改良的Supper Sf9-1、Supper Sf9-2和Supper Sf9-3細(xì)胞均能大幅度提高重組蛋白的穩(wěn)定性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益成熟，人們對(duì)桿狀病毒和昆蟲細(xì)胞系的研究將會(huì)更加深入，改造也會(huì)更多，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用也會(huì)更加廣泛，必將發(fā)揮越來越重要的作用。