哈小琴，高彩艷，李萍，陸潤蘭，李兵，宋月娟，邢媛，朱曉紅，宋薇，買志福

1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院檢驗(yàn)科甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050；2.蘭州市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種以血糖升高為主要表現(xiàn)的慢性代謝性疾病，易發(fā)生多種血管并發(fā)癥，其病理機(jī)制多涉及持續(xù)炎癥和免疫系統(tǒng)失活［1］。而外周血中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞一并統(tǒng)稱的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），在炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)監(jiān)測(cè)等事件中起重要作用。PBMCs提取技術(shù)成熟，使得以PBMCs為載體進(jìn)行糖尿病相關(guān)機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。有研究顯示，T2DM患者PBMCs與健康者在數(shù)量［2］、代謝［3］、基因表達(dá)［4］以及炎癥介質(zhì)［5］等方面均存在差異。此外，血管內(nèi)其他趨化因子、細(xì)胞因子、生長因子的分泌失衡，也影響PBMCs的增殖、分化、遷移和黏附等，其功能的改變已成為T2DM血管并發(fā)癥的有效生物標(biāo)志物［6］。且PBMCs的移植治療對(duì)于T2DM的控制具有明顯優(yōu)勢(shì)［7］。但目前關(guān)于高海拔缺氧環(huán)境下T2DM患者體內(nèi)PBMCs功能變化的相關(guān)報(bào)道較少，因此，本文就海拔對(duì)T2DM患者PBMCs遷移及黏附功能的影響進(jìn)行研究，以期為高海拔缺氧環(huán)境下T2DM患者的管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本 選取咸陽市（海拔386 m）某三甲醫(yī)院內(nèi)分泌科T2DM患者25人，體檢中心健康者20人，作為研究的低海拔組；選取蘭州市中醫(yī)醫(yī)院（海拔1 520 m）內(nèi)分泌科T2DM患者29人，體檢中心健康者20人，作為研究的高海拔組。收集所有研究對(duì)象一般資料，并采集靜脈血5 mL進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 主要試劑及儀器 ELISA試劑盒由美國R&D公司提供；兔抗人CXCR2和CXCR4單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司；RNAiso Plus試劑盒、PrimescriptTMRTMaster Mix和SYBRPermix EX TaqTMⅡreal-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；紫外分光光度計(jì)購自上海天美科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 PBM C s提取 采用密度梯度離心法。取5 mL肝素抗凝全血，按照1∶1比例加入磷酸緩沖鹽酸溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋；在新的離心管中吸取與稀釋全血等體積的淋巴細(xì)胞分離液，用毛細(xì)吸管將稀釋全血沿管壁緩慢加至新離心管中，保持與分離液形成一界面（兩者不混合）；室溫，2 616×g離心30 min，上層為血漿、血小板及PBS，中層為透明的淋巴細(xì)胞分離液，底層為紅細(xì)胞，PBMCs即為淋巴細(xì)胞分離液與上層交界處呈云霧狀的灰白色層；吸出PBMCs，加入5倍體積的PBS溶液，洗滌2次，離心后棄上清，備用。

1.4 PBM C s遷移、黏附及成血管相關(guān)因子濃度檢測(cè)采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell derived factor-1，SDF-l）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的濃度，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 PBM C s遷移、黏附及成血管相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將PBMCs用PBS溶液洗滌2次，用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280、320 nm波長處A值，計(jì)算RNA含量。用PrimescriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄cDNA，以其為模板，利用SYBR Permix EX TaqTMⅡreal-time PCR試劑盒擴(kuò)增SDF-1的受體趨化因子受體2［chemokine（C-X-C motif）receptor 2，CXCR2］、IL-8的受體趨化因子受體4（CXCR4）、白細(xì)胞功能相關(guān)抗原1（leukoctes function associatedantigent-1，LFA-1）、β-actin基因。引物序列見表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。反應(yīng)條件：90℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃31 s，PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃60 s，產(chǎn)物溶解，1個(gè)循環(huán)。以健康組數(shù)據(jù)為對(duì)照，計(jì)算各組2-ΔΔCt值（-ΔΔCt=ΔCt試驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組）。

表1 各基因引物序列Tab.1 Sequences of primers for various genes

1.6 PBM C s遷移、黏附及成血管相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取PBMCs加入RIPA裂解液，4℃冰上裂解30 min；將細(xì)胞碎片和裂解液吹打混勻，4℃，17 105.6×g離心15 min；取上清液，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉；加入兔抗人單克隆抗體CXCR2和CXCR4及抗β-actin單克隆抗體（均1∶400稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗滌，移至1 mL HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋）孵育袋內(nèi)，37℃孵育2 h；TBST洗滌，滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（A、B液等體積配比），放置1~3 min；ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行處理分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入和分析，計(jì)數(shù)資料用絕對(duì)數(shù)或百分比表示，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA方差分析。以P<0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況 兩地共納入94例研究對(duì)象，其中T2DM患者共計(jì)54例，健康者共計(jì)40例。男女比例1∶1（47／47），均為漢族人群，平均年齡（53.36±8.94）歲。

2.2 不同海拔下T2DM患者與健康者血清SD F-1、I L-8、H I F-1α、V EGF濃度 ELISA結(jié)果顯示，低海拔組中，健康者血清中各因子的表達(dá)高于T2DM患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高海拔組中，除IL-8濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（t=-1.98，P>0.05），健康者血清中其他各因子的表達(dá)高于T2DM患者，濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同海拔組內(nèi)T2DM患者與健康者血清中各因子濃度的比較（±s）Tab.2 Cytokine concentrations in sera of patients with T2DM and healthy peoples in high and low altitude groups（±s）

表2 不同海拔組內(nèi)T2DM患者與健康者血清中各因子濃度的比較（±s）Tab.2 Cytokine concentrations in sera of patients with T2DM and healthy peoples in high and low altitude groups（±s）

組別 例數(shù) SDF-1（ng／mL） IL-8（ng／L） HIF-1α（ng／mL） VEGF（ng／L）低海拔組T2DM患者 25 1.24±0.68 5.57±0.51 1.28±0.54 7.16±0.63健康者 20 1.36±0.69 5.66±0.65 1.28±0.65 7.24±0.79 t-0.560 -0.430 -0.001 -0.330 P 0.579 0.669 0.999 0.747高海拔組T2DM患者 29 2.62±0.82 1.38±0.85 7.09±0.82 5.47±0.83健康者 20 3.20±0.63 1.84±0.68 7.60±0.60 5.96±0.58 t-2.620 -1.980 -2.330 -2.270 P 0.014 0.058 0.028 0.032

2.3 PBM C s中LFA-1、CXCR2和CXCR4基因的相對(duì)表達(dá)量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，低海拔組和高海拔組LFA-1、CXCR2和CXCR4基因相對(duì)表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低海拔組T2DM患者較健康者CXCR2基因相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.036，P<0.001），LFA-1和CXCR4基因相對(duì)表達(dá)量也降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高海拔組T2DM患者較健康者各基因相對(duì)表達(dá)量均降低，但除LFA-1基因相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其他兩個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

表3 不同海拔組T2DM患者與健康者PBMCs各基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（±s）Tab.3 Transcription levels of various genes in PBMCsof patients with T2DMand healthy peoples in high and low altitude groups（±s）

表3 不同海拔組T2DM患者與健康者PBMCs各基因轉(zhuǎn)錄水平的比較（±s）Tab.3 Transcription levels of various genes in PBMCsof patients with T2DMand healthy peoples in high and low altitude groups（±s）

組別 例數(shù) LFA-1 CXCR2 CXCR4低海拔組T2DM患者 25 1.06±0.75 0.48±0.05 0.92±0.10健康者 20 1.13±0.60 1.40±0.85 1.10±0.11 t-0.186 -4.036 -0.071 P>0.050 <0.001 >0.050高海拔組T2DM患者 29 0.94±0.06 0.71±0.05 0.41±0.04健康者 20 1.04±0.07 1.12±0.02 1.43±0.40 t-0.083 -2.315 -7.468 P>0.050 <0.001 <0.001

2.4 PBM C s中C X C R2和C X C R4蛋白表達(dá)水平Western blot分析顯示，低海拔組健康者CXCR2和CXCR4蛋白表達(dá)水平最高，而高海拔組T2DM患者CXCR2和CXCR4蛋白表達(dá)水平最低，低海拔組較高海拔組CXCR2和CXCR4蛋白表達(dá)水平升高（tCXCR2=-4.769，tCXCR4=-6.093，P<0.05）。高海拔組和低海拔組健康者CXCR2和CXCR4蛋白表達(dá)水平均高于T2DM患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tCXCR2=-3.045，tCXCR4=-1.087，P<0.05）。見圖1和圖2。

圖1 PBMCs表面各相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot分析Fig.1 Western blotting of expression of relevant proteins on surface of PBMCs

圖2 不同海拔組間PBMCs表面各相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較Fig.2 Expression levels of relevant proteins on surface of PBMCs in high and low altitude groups

3 討論

T2DM前狀態(tài)以及糖尿病整個(gè)發(fā)展過程中均伴有慢性炎癥反應(yīng)，多種炎性細(xì)胞、因子參與其中［8］，影響著糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［9］。且隨著海拔升高，機(jī)體PBMCs中HIF-1α的表達(dá)增強(qiáng)，以此適應(yīng)缺氧環(huán)境，維持機(jī)體代謝［10］。

本研究顯示，高海拔地區(qū)研究對(duì)象相比低海拔地區(qū)血清HIF-1α表達(dá)升高，且高海拔T2DM患者的表達(dá)更為顯著，這與EBROWSKA等［11］的研究結(jié)果一致，提示高海拔地區(qū)T2DM患者相比低海拔地區(qū)T2DM患者機(jī)體缺氧更為嚴(yán)重。此外VEGF作為HIF-1α的下游靶因子，受其正向調(diào)節(jié)，對(duì)于高糖和缺氧引起的血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用［12］。而本研究結(jié)果顯示，血清VEGF和HIF-1α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，高海拔地區(qū)VEGF水平低于低海拔地區(qū)，且在高海拔地區(qū)T2DM患者中差異更明顯?？赡苁情L期高海拔缺氧和高糖環(huán)境使得HIF-1α對(duì)VEGF的調(diào)節(jié)受損，使之不能發(fā)揮促血管生成的作用［13］?；蛘哂捎诒敬胃吆０蔚貐^(qū)海拔僅為1 520米，相比于3 000米以上地區(qū)缺氧程度較低，VEGF表達(dá)處于過渡性的暫時(shí)下調(diào)狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)制為由代償向失代償?shù)霓D(zhuǎn)變中［14］。

SDF-1（CXCL12）是由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的趨化因子，可通過與其特異性受體CXCR4結(jié)合，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的歸巢，參與多種炎癥細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的分化、遷移、浸潤和募集，與血管形成、血管壁炎性反應(yīng)相關(guān)［15-16］。因此，SDF-1／CXCR4軸對(duì)于糖尿病大小血管炎癥和血管再生起重要作用。本研究顯示，SDF-1的表達(dá)與HIF-1α成正相關(guān)。這是由于在缺氧情況下，HIF-1α?xí)蛘T導(dǎo)SDF-1表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、歸巢以促進(jìn)血管生成［17］。然而SDF-1與其調(diào)控的受體CXCR4基因及蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果顯示高海拔組低于低海拔組，高海拔組T2DM患者與低海拔組T2DM患者也相同，與相關(guān)研究結(jié)果［18］相反。提示海拔的升高導(dǎo)致對(duì)CXCR4基因及蛋白的調(diào)控出現(xiàn)異常。此外結(jié)果還顯示，SDF-1調(diào)節(jié)的LFA-1基因在高海拔組表達(dá)降低，顯示出與SDF-1表達(dá)相反的關(guān)系。這與SDF-1下調(diào)LFA-1的活性，抑制PBMCs的黏附級(jí)聯(lián)的作用有關(guān)［19-20］。LFA-1作為白細(xì)胞表面分泌的一種整合素，通常與ICAM-1結(jié)合，參與包括PBMCs在內(nèi)的多種白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用［21］。由此可知，在高海拔下，尤其是高海拔的糖尿病患者中SDF-1雖然對(duì)其配體基因的調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂，無法實(shí)行血管內(nèi)皮的修復(fù)作用，但可以正常抑制炎癥細(xì)胞之間的黏附聚集，防止血管動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

IL-8（CXCL8）是一種重要的炎性因子，也是白細(xì)胞分泌的趨化因子和化學(xué)調(diào)節(jié)劑。通常與其配體CXCR2結(jié)合響應(yīng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，募集炎癥細(xì)胞向內(nèi)皮遷移，影響內(nèi)皮因子的釋放及血管張力，引起內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的形成［22］。本研究結(jié)果顯示，與低海拔組T2DM患者相比，高海拔組T2DM患者IL-8水平、CXCR2基因及蛋白水平均較低。與DERAKHSHAN等［23］對(duì)T2DM患者外周血PBMCs中檢測(cè)的IL-8結(jié)果相反。這可能是受海拔影響，使得HIF-1α在單核細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中抑制Nrf2轉(zhuǎn)錄因子，從而降低了IL-8的表達(dá)［24-25］。也可能高濃度的SDF-1抑制IL-8的表達(dá)，起到抑制血管斑塊形成的作用［26］，但兩者之間的具體機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，本研究結(jié)果提示高海拔組T2DM患者PBMCs的遷移能力增強(qiáng)，與血管內(nèi)皮之間的黏附作用減低，成血管能力減弱，處于動(dòng)脈粥樣硬化形成的初期階段。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果相反，可能與調(diào)查點(diǎn)海拔不高，以及在該地長期居住的T2DM患者以及健康者本身受缺氧影響，機(jī)體發(fā)生了適應(yīng)性代償，在代謝水平上與其他較低海拔地區(qū)的糖尿病患者和健康者之間本身存在差異有關(guān)。當(dāng)然，因受本研究基金及實(shí)驗(yàn)條件的限制，所選樣本量較少，未按糖尿病血管并發(fā)癥分類進(jìn)行進(jìn)一步的分層分析，可能使結(jié)果出現(xiàn)一定偏倚。此外，本研究是基于海拔因素對(duì)T2DM患者PBMCs功能變化情況進(jìn)行了體外試驗(yàn)的分析，目前相似研究較少，值得相關(guān)學(xué)者借鑒。同時(shí)也使得通過PBMCs的移植治療高海拔T2DM成為可能。但需要日后大樣本的調(diào)查及體內(nèi)試驗(yàn)的進(jìn)一步論證。