張莉莉 張?zhí)K琳 唐力 王文娟 戴清 江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評(píng)中心 （江蘇 南京 210002）

內(nèi)容提要： 參考區(qū)間是定量體外診斷試劑的重要參數(shù)。從技術(shù)審評(píng)的角度分析企業(yè)在確定參考區(qū)間過程中常見的問題并提出幾點(diǎn)建議，旨在提高企業(yè)設(shè)計(jì)開發(fā)效率和臨床評(píng)價(jià)成功率。

近年來我國(guó)體外診斷試劑產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，回顧過去幾年我省體外診斷試劑申報(bào)注冊(cè)受理量可知，呈逐年遞增之勢(shì)，且增速明顯。然而從申報(bào)注冊(cè)主體的角度講，體外診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)普遍規(guī)模比較小，產(chǎn)品注冊(cè)專員和研發(fā)人員的流動(dòng)性大，整體素質(zhì)有待于進(jìn)一步提高，這也制約了體外診斷試劑行業(yè)發(fā)展。與此同時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)對(duì)注冊(cè)申報(bào)相關(guān)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)指導(dǎo)原則掌握得還不夠全面，注冊(cè)申報(bào)資料在合規(guī)性性等方面仍存在較多問題。本文主要就二類體外診斷試劑定量產(chǎn)品的參考區(qū)間確定資料，從技術(shù)審評(píng)的角度談一些常見的問題以及建議。

根據(jù)我國(guó)醫(yī)療器械監(jiān)管法規(guī)要求，第二類體外診斷試劑產(chǎn)品在上市前應(yīng)進(jìn)行注冊(cè)審評(píng)審批，注冊(cè)申報(bào)資料應(yīng)符合《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第680號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局第5號(hào)）、原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（2014年第44號(hào)）等相關(guān)配套法規(guī)規(guī)章文件的要求。其中上述44號(hào)公告相關(guān)附件對(duì)體外診斷試劑產(chǎn)品各注冊(cè)類型所需提交的注冊(cè)資料，作出了具體要求。其中參考區(qū)間確定資料即為重要申報(bào)資料之一。然而部分企業(yè)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)階段過多的重視產(chǎn)品臨床性能評(píng)價(jià)，而忽視了對(duì)產(chǎn)品各性能指標(biāo)及重要參數(shù)做全面而系統(tǒng)的研究評(píng)價(jià)。定量體外診斷試劑產(chǎn)品的關(guān)鍵參數(shù)之一即為參考區(qū)間。從邏輯的角度來講，準(zhǔn)確地建立定量體外診斷試劑產(chǎn)品的參考區(qū)間可以大幅度的提高臨床評(píng)價(jià)結(jié)果滿足評(píng)價(jià)指標(biāo)的概率，反之可能對(duì)臨床評(píng)價(jià)結(jié)果造成不利影響，甚至可能導(dǎo)致整個(gè)研發(fā)工作重頭再來，這不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也對(duì)生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大資金壓力。

1.參考區(qū)間概念及注冊(cè)申報(bào)基本要求

中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402-2012中指出：參考區(qū)間（Reference interval）兩參考限之間（包括兩參考限）的區(qū)間。注1：參考區(qū)間是指從參考下限到參考上限的區(qū)間，通常是中間95%區(qū)間。在某些情況下只有一個(gè)參考限具有臨床意義，通常是參考上限，這時(shí)的參考區(qū)間是0到參考上限。注2：參考區(qū)間在我國(guó)通常又稱為“參考范圍”“正常范圍”“正常值”等，但“參考區(qū)間”是目前國(guó)際通用規(guī)范術(shù)語[1]。

原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（2014年第44號(hào)）中要求企業(yè)提供的定量體外診斷試劑參考區(qū)間確定資料：應(yīng)當(dāng)詳細(xì)說明參考區(qū)間確定的方法或依據(jù)，說明確定參考區(qū)間所采用的樣本來源，并提供參考區(qū)間確定的詳細(xì)試驗(yàn)資料及總結(jié)[2]。

2.參考區(qū)間技術(shù)審評(píng)常見問題及建議

2.1 注冊(cè)資料中參考區(qū)間確定方法不明確或不合理

很多企業(yè)在體外診斷試劑擬注冊(cè)產(chǎn)品申報(bào)資料中提供的參考區(qū)間確定資料沒有明確表述該產(chǎn)品參考區(qū)間的確定方法是什么，資料中直接給出試驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及試驗(yàn)結(jié)果。還有部分企業(yè)，可能出于研發(fā)成本及時(shí)效的考慮，在參考區(qū)間確定資料中，提供引用文獻(xiàn)或者其他企業(yè)同類產(chǎn)品說明書，以表明引用文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)作為該產(chǎn)品參考區(qū)間或者轉(zhuǎn)移其他企業(yè)同類產(chǎn)品參考區(qū)間作為該產(chǎn)品參考區(qū)間。資料中缺少對(duì)引用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或轉(zhuǎn)移其他企業(yè)同類產(chǎn)品參考區(qū)間適用性的分析和必要的臨床樣本驗(yàn)證。

美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）的EP28-A3文件中指出，定量體外診斷試劑參考區(qū)間確定方法一般有：①建立參考區(qū)間，②轉(zhuǎn)移參考區(qū)間，③驗(yàn)證參考區(qū)間[3]。

建立參考區(qū)間，包括所有的步驟，從選擇參考個(gè)體開始，通過準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析收集的數(shù)據(jù)，最終得出結(jié)論。適用情況有：①新分析物參考區(qū)間的建立；②不同群體參考區(qū)間的建立；③靈敏度和特異性提高了的新的分析方法參考區(qū)間的建立。

轉(zhuǎn)移參考區(qū)間，使已建立好的參考區(qū)間適用于新的檢測(cè)系統(tǒng)或新的檢測(cè)人群的過程。適用的情況：預(yù)先已檢測(cè)過的分析物參考區(qū)間的建立，即把一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間轉(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室。但是需要待測(cè)試的群體和分析系統(tǒng)相同或者具有可比性，轉(zhuǎn)移才能被認(rèn)可和接受?？山邮軈⒖紖^(qū)間轉(zhuǎn)移的必要條件包括：檢測(cè)系統(tǒng)的可比性；檢測(cè)人群的可比性。選擇這種方法確定產(chǎn)品參考區(qū)間時(shí)，需要先對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)與比對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)和偏差評(píng)估，只有相關(guān)系數(shù)和偏倚在規(guī)定的范圍內(nèi)，才可轉(zhuǎn)移。

驗(yàn)證參考區(qū)間，即通過相對(duì)較少的參考個(gè)體，將其他地方建立或轉(zhuǎn)移的參考區(qū)間在當(dāng)?shù)厥褂玫暮侠磉^程。適用于驗(yàn)證建立的或轉(zhuǎn)移的參考區(qū)間是否可接受。目前，建議三種方法用來評(píng)估參考區(qū)間轉(zhuǎn)移的可接受性：①主觀驗(yàn)證；②使用少量的參考個(gè)體驗(yàn)證（如，n≥20）；③使用大樣本量的參考個(gè)體驗(yàn)證（但少于建立參考區(qū)間需要的n≥120）。選擇這種方法確定產(chǎn)品參考區(qū)間，需要考慮接收實(shí)驗(yàn)室的操作必須和原始參考值研究的分析前和分析中各因素的控制保持一致[4]。

2.2 研究參考區(qū)間時(shí)樣本的入排標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立不具體，千篇一律，對(duì)分析物無針對(duì)性

企業(yè)申報(bào)資料，經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象，尤其是同一個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的申報(bào)資料，即便是不同檢測(cè)指標(biāo)，其參考區(qū)間確定資料中研究樣本的入排標(biāo)準(zhǔn)卻一模一樣，缺乏對(duì)分析物或臨床適應(yīng)癥的針對(duì)性，這就對(duì)后期參考區(qū)間研究結(jié)果的準(zhǔn)確性造成了隱患。

一般來說，參考區(qū)間研究的樣本為表觀健康人群。需要確立統(tǒng)一的，具體的選擇和排除標(biāo)準(zhǔn)，從而選擇“相對(duì)健康”的參考個(gè)體。因研究臨床檢測(cè)分析物不同，所設(shè)計(jì)的排除標(biāo)準(zhǔn)也各不相同。通常避免直接選用一般意義上的年輕又健康的成年人，可以選用非常類似于患者群的人群。如果分析物對(duì)參考個(gè)體有分組的必要性，可以建立分組標(biāo)準(zhǔn)，將全部篩選出來的參考個(gè)體，按照有意義的分類法進(jìn)行分組，例如按年齡、性別、月經(jīng)周期或孕周期等進(jìn)行分組。此外檢測(cè)樣本的具體情況，也應(yīng)該在研究參考區(qū)間時(shí)納入考慮，例如不同樣本類型的樣本應(yīng)分別進(jìn)行研究，如尿液、血液、腦脊液等。不同采血位置應(yīng)分別進(jìn)行研究，如指尖血、靜脈血等。

2.3 參考區(qū)間研究樣本量不符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求

部分企業(yè)不清楚參考區(qū)間研究樣本量如何確定，沒有從產(chǎn)品自身特性、影響因素出發(fā)，直接設(shè)定某個(gè)數(shù)量，從而收集樣本進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，這樣的研究方法是不科學(xué)的，研究結(jié)果也會(huì)遭到質(zhì)疑。

研究檢測(cè)指標(biāo)參考區(qū)間時(shí)，首先要考慮該檢測(cè)指標(biāo)的臨床含義，從而決定參考區(qū)間報(bào)告結(jié)果是單側(cè)范圍或雙側(cè)范圍。參考區(qū)間指的是兩個(gè)數(shù)（含這兩個(gè)數(shù)）之間，即最高限和最低限的之間的全部數(shù)組成的區(qū)間，從參考人群中抽出來的個(gè)體檢測(cè)值可以用一個(gè)特定的百分比（通常是95%）來評(píng)估。故雙側(cè)區(qū)間可取第2.5和第97.5個(gè)百分位點(diǎn)；單側(cè)上限取95%百分位點(diǎn)；單側(cè)下限取5%百分位點(diǎn)[4]。

參考區(qū)間研究樣本量一般依據(jù)計(jì)算參考樣本組的百分位數(shù)值的置信區(qū)間（CI）來識(shí)別和評(píng)定，如果待測(cè)物屬于雙側(cè)指標(biāo)，按照公式（1）計(jì)算確定樣本數(shù)量[4]。

如參考區(qū)間取單側(cè)下限或單側(cè)上限，以5%或95%位置計(jì)參考限，按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算確定樣本數(shù)量[4]。

2.4 參考區(qū)間研究中統(tǒng)計(jì)分析不完善或不合理

企業(yè)申報(bào)資料中參考區(qū)間統(tǒng)計(jì)分析常見問題有：①原始數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計(jì)的科學(xué)性和有效性未保證，部分超出線性范圍或低于線性范圍的數(shù)據(jù)直接納入統(tǒng)計(jì)，未作說明，不能保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。②原始數(shù)據(jù)未作離群值分析，直接進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。③原始數(shù)據(jù)分布類型未確定，不能保證選擇的計(jì)算方法是否科學(xué)有效，不能保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

針對(duì)上述參考區(qū)間確定資料中的幾點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析問題，從技術(shù)審評(píng)的角度，提出幾點(diǎn)建議：①企業(yè)研究者應(yīng)保證參考區(qū)間研究中納入統(tǒng)計(jì)的原始數(shù)據(jù)科學(xué)有效，對(duì)于低于線性范圍的數(shù)據(jù)不應(yīng)納入統(tǒng)計(jì)，對(duì)于超出線性范圍的數(shù)據(jù)，應(yīng)做說明，闡述清楚這部分?jǐn)?shù)據(jù)如何得來，如稀釋后檢測(cè)，回乘稀釋倍數(shù)所得等。②無論采用哪種方法建立參考區(qū)間，均應(yīng)進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。如有離群點(diǎn)被剔除，應(yīng)補(bǔ)充樣本量至所設(shè)置的最少樣本量。③原始數(shù)據(jù)分布類型不同，運(yùn)用的參考區(qū)間計(jì)算方法也不同。根據(jù)EP28-A3、WS/T402-2012以及國(guó)內(nèi)的研究資料，可將參考區(qū)間的估計(jì)方法分為兩種，正態(tài)分布法（參數(shù)法）和百分位點(diǎn)法（非參數(shù)法）。

正態(tài)分布法參考區(qū)間的計(jì)算方法見表1[4]。

表1. 正態(tài)分布參考區(qū)間計(jì)算方法

百分位數(shù)法參考區(qū)間的計(jì)算方法見表2。

表2. 百分位數(shù)法參考區(qū)間計(jì)算方法

3.小結(jié)

本文主要總結(jié)和分析了企業(yè)產(chǎn)品申報(bào)資料中參考區(qū)間確定過程中的常見問題，并結(jié)合技術(shù)審評(píng)工作中審查該部分資料關(guān)注的要點(diǎn)，給出幾點(diǎn)建議，供行業(yè)內(nèi)相關(guān)人員學(xué)習(xí)、參考、與交流。建議生產(chǎn)企業(yè)在設(shè)計(jì)開發(fā)階段，結(jié)合產(chǎn)品的臨床預(yù)期用途和產(chǎn)品的技術(shù)特點(diǎn)，選擇科學(xué)的方法，準(zhǔn)確建立產(chǎn)品的參考區(qū)間，提高產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)的效率以及臨床試驗(yàn)成功的概率。