杜 錕 ，田夢(mèng)茹，盛丹陽(yáng)，袁明昊，王琰琰，李夢(mèng)園，支燕樂(lè) ，馬金蓮，薛貴民 ，陳 輝 ，孫彥君 ，馮衛(wèi)生

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046

3.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046

野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi系豆科（Leguminosae）葛屬PuerariaDC.植物，主產(chǎn)于河南、湖南、浙江、四川等地，藥用其根莖。葛根是我國(guó)的常用中藥，被《中國(guó)藥典》2015年版記載，其味甘、辛，性涼。歸脾、胃、肺經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明葛根在調(diào)血脂、抗氧化和抗抑郁活性等方面具有顯著的藥用價(jià)值[2-4]。目前報(bào)道的葛根化學(xué)成分主要有黃酮類(lèi)、葛酚苷類(lèi)、香豆素類(lèi)、三萜及其皂苷類(lèi)化合物[5]。其中，異黃酮類(lèi)化合物為葛根的主要化學(xué)成分。為進(jìn)一步豐富葛根化學(xué)成分的研究，完善其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)從葛根中分離得到11個(gè)化合物，分別鑒定為葛檀素（pueracarpanin，1）、芒柄花苷（ononin，2）、大豆苷（daidzin，3）、大豆素（daidzein，4）、4′,8-dimethoxy-7-O-β-D-glucopyranosylisoflavone，5）、異芒柄花苷（isoononin，6）、染料木素（genistein，7）、formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-Dglucopyranoside（8）、7,2′,4′-trihydroxyisoflavone（9）、3′-methoxydaidzein（10）和芒柄花素（formononetin，11）。其中化合物1為1個(gè)新的6a,11a-脫氫紫檀素，化合物8和9為首次從葛屬植物中分離得到。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500型核磁共振儀、Bruker maxis HD型飛行時(shí)間質(zhì)譜（德國(guó)Bruker公司）；Autopol IV全自動(dòng)旋光儀（美國(guó)魯?shù)婪蚬荆籉lexa型中壓制備液相色譜儀（博納艾杰爾公司，含F(xiàn)L-H050G型半制備型高壓輸液泵，HP-Q-UV100型紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm和254 nm；Agela technologies型色譜工作站）。LC52型高壓制備液相色譜儀（賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030型半制備型高壓輸液泵，UV200型紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm和254 nm；Easychrom型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A，250 mm×20 mm，5 μm）。薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；RP-C18（40～60 μm，YMC公司）；大孔樹(shù)脂Diaion HP-20（日本三菱化學(xué)）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其他試劑均為分析級(jí)。

葛根于2018年5月購(gòu)自鄭州市藥材市場(chǎng)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為豆科葛屬植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi的根莖。憑證樣本（ID-20180520）存于河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)研究室。

2 提取與分離

葛根干燥根莖10 kg，醋酸乙酯和甲醇依次浸泡提取2次，濾過(guò)，合并提取液，減壓濃縮，分別得到醋酸乙酯浸膏35 g和甲醇浸膏320 g。甲醇浸膏（100 g）經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂Dianion柱色譜（70 cm×8 cm）分離，依次用水-乙醇（10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10）梯度洗脫，并經(jīng)硅膠薄層色譜檢識(shí)，合并相同流分得到6個(gè)組分（Fr.A～F）。Fr.C（25 g）經(jīng)中低壓RP-C18柱色譜（25 cm×5 cm）分離，依次用10%～100%甲醇（體積流量10 mL/min）梯度洗脫，得到9個(gè)亞流分（Fr.C-1～C-9）。Fr.C-9重結(jié)晶得到化合物3（505 mg）。Fr.E（32 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜純化（甲醇），并經(jīng)硅膠薄層色譜檢識(shí)，合并相同流分得到9個(gè)組分（Fr.E-1～E-9）。Fr.E-2（5 g）經(jīng)中低壓RP-C18柱色譜（19 cm×3 cm）分離，依次用甲醇-水（10%→100%甲醇，體積流量10 mL/min）梯度洗脫，得到9個(gè)亞流分（Fr.E-2-1～E-2-9）。Fr.E-2-2（2 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、15∶1、10∶1）洗脫，得到組分10個(gè)亞流分（Fr.E-2-2-1～E-2-2-10）。Fr.E-2-2-6經(jīng)制備型HPLC制備（65%甲醇，體積流量3 mL/min）得到化合物2（20.5 mg，tR＝11.5 min）、6（10.6 mg，tR＝12.5 min）。Fr.E-2-2-9經(jīng)制備型HPLC制備（30%乙腈，體積流量3 mL/min）得到化合物8（5.5 mg，tR＝10.5 min）。Fr.E-2-3（700 mg）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1）梯度洗脫，得到8個(gè)組分（Fr.E-2-3-1～E-2-3-8）。Fr.E-2-3-8經(jīng)制備型HPLC制備（25%乙腈，體積流量3 mL/min）分離得到化合物5（15.2 mg，tR＝23.0 min）。Fr.E-5（500 mg）經(jīng)中低壓RP-C18柱色譜（19 cm×3 cm）分離，依次用10%～100%甲醇（體積流量10 mL/min）梯度洗脫，得到16個(gè)亞流分（Fr.E-5-1～E-5-16）。Fr.E-5-3、Fr.E-5-7和Fr.E-5-10經(jīng)制備型HPLC制備（溶劑分別為30%乙腈、80%甲醇、75%乙腈，體積流量3 mL/min）分別得到化合物9（4.5 mg，tR＝11.5 min）、4（10.3 mg，tR＝12.0 min）和1（2.5 mg，tR＝34.5 min）。Fr.E-7（1 g）經(jīng)中低壓RP-C18柱色譜（19 cm×3 cm）分離，依次用10%～100%甲醇（體積流量10 mL/min）梯度洗脫，得到18個(gè)亞流分（Fr.E-7-1～E-7-18）。Fr.E-7-8經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（25∶1、20∶1、15∶1、10∶1）洗脫，得到化合物7（6.5 mg）。葛根甲醇浸膏（100 g）加水混懸，用醋酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得醋酸乙酯部位（40 g）。醋酸乙酯部位（35 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用二氯甲烷-甲醇（30∶1、25∶1、15∶1、10∶1）洗脫，得到組分5個(gè)亞流分（Fr.1～5）。Fr.3（5 g）經(jīng)中低壓RP-C18柱色譜（19 cm×3 cm）分離，依次用10%～100%甲醇（體積流量10 mL/min）梯度洗脫，得到18個(gè)亞流分（Fr.3-1～3-18）。Fr.3-15重結(jié)晶得到化合物10（6.6 mg）。Fr.3-20經(jīng)制備型HPLC制備（80%甲醇，體積流量3 mL/min）得到化合物11（10.5 mg，tR＝13.5 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of compound 1

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR波譜數(shù)據(jù) (500/125 MHz, DMSO-d6)Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1(500/125 MHz, DMSO-d6)

圖1 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY和HMBC相關(guān)Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1屬于紫檀素類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性[7-8]，并且從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的較少，2012—2017年僅有32個(gè)新紫檀素類(lèi)化合物被報(bào)道[8]?；衔?的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了紫檀素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型。

化合物2：白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.43 (1H, s, H-2),8.05 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.53 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 7.24 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,J= 8.8, 1.4 Hz, H-6), 6.99 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′,5′), 5.10 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-1′′), 3.78 (3H, s,OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.7(C-4), 161.4 (C-7), 159.0 (C-4′), 157.0 (C-9), 153.6(C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 126.9 (C-3), 124.0 (C-1′),123.4 (C-5), 118.4 (C-10), 115.6 (C-6), 113.6 (C-3′,5′), 103.4 (C-8), 100.0 (C-1′′), 77.2 (C-5′′), 76.4(C-3′′), 73.1 (C-2′′), 69.6 (C-4′′), 60.6 (C-6′′), 55.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定化合物2為芒柄花苷。

化合物3：白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.38 (1H, s, H-2),8.04 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.40 (2H, d,J= 8.4 Hz,H-2′, 6′), 7.23 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-8), 7.14 (1H, dd,J= 8.8, 1.7 Hz, H-6), 6.81 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3′,5′), 5.10 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-1′′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.7 (C-4), 161.4 (C-7), 157.2(C-4′), 157.0 (C-9), 153.3 (C-2), 130.0 (C-2′, 6′), 126.9(C-3), 123.7 (C-1′), 122.3 (C-5), 118.4 (C-10), 115.5(C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 103.3 (C-8), 100.0 (C-1′), 77.2(C-5′′), 76.4 (C-3′), 73.1 (C-2′′), 69.6 (C-4′′), 60.6(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物3為大豆苷。

化合物4：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.27 (1H, s, H-2), 7.94 (1H,d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.37 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′),6.91 (1H, dd,J= 8.8, 1.8 Hz, H-6), 6.83 (1H, d,J=1.8 Hz, H-8), 6.80 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.6 (C-4), 162.6(C-7), 157.4 (C-4′), 157.1 (C-9), 152.7 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 127.2 (C-3), 123.4 (C-1′), 122.5 (C-5),116.5 (C-10), 115.1 (C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 102.0(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物4為大豆素。

化合物5：白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48 (1H, s, H-2),7.80 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-5), 7.52 (2H, d,J= 8.7 Hz,H-2′, 6′), 7.36 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-6), 7.00 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.10 (1H, overlapped d,J= 7.2 Hz, H-1′′), 3.94 (3H, s, 8-OCH3), 3.78 (3H, s,4′-OCH3), 3.18～3.74 (6H, m, Glc-H-2′′～6′′)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.8 (C-4), 159.0(C-4′′), 154.0 (C-7), 153.6 (C-2), 150.0 (C-9), 136.8(C-8), 130.0 (C-2′, 6′), 123.9 (C-1′), 123.0 (C-3),120.3 (C-5), 119.3 (C-10), 113.9 (C-6), 113.6 (C-3′,5′), 100.4 (C-1′′), 77.2 (C-5′′), 76.6 (C-3′′), 73.2(C-2′′), 69.5 (C-4′′), 61.2 (8-OCH3), 60.5 (C-6′′), 55.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物5為4′,8-dimethoxy-7-O-β-D-glucopyranosylisoflavone。

化合物6：白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.43 (1H, s, H-2),8.03 (1H, d,J= 8.8 Hz, H-5), 7.51 (2H, d,J=8.5 Hz,H-2′, 6′), 7.16 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 7.08 (1H,overlapped, H-6), 7.08 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′),4.90 (1H, d,J= 7.3 Hz, H-1″), 3.90 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 174.7 (C-4), 163.8(C-7), 157.5 (C-9), 157.2 (C-4′), 153.7 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 127.0 (C-5), 125.3 (C-3), 123.4 (C-1′),117.6 (C-10), 116.0 (C-6), 114.9 (C-3′, 5′), 100.6(C-8), 100.4 (C-1″), 77.1 (C-5″), 76.6 (C-3″), 73.3(C-2″), 69.7 (C-4″), 60.7 (C-6″), 56.2 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物6為異芒柄花苷。

化合物7：淡黃色無(wú)定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.94 (1H, s,5-OH), 8.30 (1H, s, H-2), 7.36 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 6.81 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.36 (1H,d,J= 1.4 Hz, H-6), 6.20 (1H, d,J= 1.4 Hz, H-8)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 180.1 (C-4), 164.7(C-7), 161.9 (C-5), 157.6 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.8(C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 122.2 (C-3), 121.2 (C-1′),115.0 (C-3′, 5′), 104.3 (C-10), 99.0 (C-6), 93.7 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物7為染料木素。

化合物8：白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.39 (1H, s, H-2),8.07 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-5), 7.53 (2H, d,J= 8.8 Hz,H-2′, 6′), 7.24 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,J= 8.9, 1.9 Hz, H-6), 7.00 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3′,5′), 5.04 (1H, d,J= 6.4 Hz, H-1″), 4.82 (1H, d,J= 2.8 Hz, H-1′′′), 3.79 (3H, s, 4′-OCH3), 4.47～5.51 (6H, m,glc, api-OH), 3.07～3.96 (m, glc, api-H)；13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.6 (C-4), 161.3 (C-7),159.0 (C-4′), 157.0 (C-9), 153.6 (C-2), 130.0 (C-2′,6′), 127.0 (C-5), 124.0 (C-1′), 123.3 (C-3), 118.5(C-10), 115.4 (C-6), 113.6 (C-3′, 5′), 109.3 (C-1′′′),103.6 (C-8), 100.0 (C-1′′), 78.6 (C-3′′′), 76.4 (C-3′′),75.9 (C-2′′′), 75.6 (C-5′′), 73.2 (C-4′″), 73.0 (C-2″),69.9 (C-4″), 67.7 (C-6″), 63.1 (C-5″′), 55.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物8為formononetin-7-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranoside。

化合物9：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.13 (1H, s, H-2), 7.92 (1H,d,J= 8.7 Hz, H-5), 6.97 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6′),6.91 (1H, brd,J= 8.7 Hz, H-6), 6.83 (1H, brs, H-8),6.35 (1H, brs, H-3′), 6.26 (1H, brd,J= 8.2 Hz, H-5′)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 175.2 (C-4), 162.9(C-7), 158.3 (C-4′), 157.5 (C-9), 156.4 (C-2′), 154.2(C-2), 132.0 (C-6′), 127.1 (C-5), 121.7 (C-3), 116.3(C-10), 115.2 (C-6), 110.2 (C-1′), 106.3 (C-5′), 102.9(C-3′), 102.0 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物9為7,2′,4′-trihydroxyisoflavone。

化合物10：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.31 (1H, s, H-2),7.96 (1H, d,J= 8.7 Hz, H-5), 7.16 (1H, d,J= 1.8 Hz,H-2′), 6.98 (1H, dd,J= 8.2, 1.8 Hz, H-6′), 6.93 (1H,dd,J= 8.7, 2.1 Hz, H-6), 6.85 (1H, d,J= 2.1 Hz,H-8), 6.81 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′), 3.79 (3H, s,OCH3)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 174.8(C-4), 162.5 (C-7), 157.3 (C-9), 153.0 (C-2), 147.1(C-3′), 146.4 (C-4′), 127.3 (C-5), 123.5 (C-3), 123.0(C-1′), 121.5 (C-5′), 116.6 (C-10), 115.2 (C-6), 115.1(C-6′), 113.2 (C-2′), 102.1 (C-8), 55.6 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物10為3′-methoxydaidzein。

化合物11：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.33 (1H, s, H-2),7.96 (1H, d,J= 8.7 Hz, H-5), 7.50 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2′, 6′), 6.98 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.93 (1H,dd,J= 8.7, 2.0 Hz, H-6), 6.86 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 3.78 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 174.5 (C-4), 162.6 (C-7), 158.9 (C-4′),157.4 (C-9), 153.1 (C-2), 130.0 (C-2′, 6′), 127.2 (C-5),124.2 (C-1′), 123.1 (C-3), 116.5 (C-10), 115.2 (C-6),113.5 (C-3′, 5′), 102.1 (C-8), 55.6 (4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物11為芒柄花素。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突