馬貝貝,婁天宇,梁耀月,王婷婷,李瑞吉,劉金輝,王晨曉,于尚玥,郭玉東,王 晶*,王志斌
1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488
2.北京市藥品檢驗(yàn)所,北京 102200
3.同仁堂科技發(fā)展股份有限公司,北京 100071
桔紅素(tangeretin),又被稱(chēng)為橘紅素、蜜桔素、桔皮素或5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮,作為一種天然的多甲氧基黃酮類(lèi)化合物(polymethoxylated flavones,PMFs),主要存在于蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumLinn.和川橘C.nobilisLour.的果皮以及柑橘C.reticulataBlanco.的葉和莖中[1-3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明,桔紅素具有較強(qiáng)的藥理活性,如可減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷、抑制氧化應(yīng)激和炎癥、保護(hù)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及抑制鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等[4-7]。此外,桔紅素還可抗腫瘤、抗癲癇以及阻斷病毒融合、治療拉沙病毒引起的病毒性出血熱,被廣泛應(yīng)用于食品保健和醫(yī)學(xué)研究[8-10]。然而有關(guān)桔紅素的體內(nèi)代謝研究卻鮮有報(bào)道,急需一種快速有效的分析方法詳細(xì)闡明桔紅素的代謝產(chǎn)物和代謝途徑[11-12]。
超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)(UHPLCHRMS)將色譜分離與質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析相結(jié)合,同時(shí)具備高選擇性、高靈敏度及高精準(zhǔn)度的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),使迅速分離成分與結(jié)構(gòu)信息獲取一體化,從而頻繁應(yīng)用于藥物成分檢測(cè)和快速篩查[13-16]。四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive Orbitrap MS)將四極桿對(duì)母離子的高選擇性與提供準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的高分辨Orbitrap技術(shù)相統(tǒng)一,檢出限度小,質(zhì)量偏差范圍窄,可顯著消除樣品基質(zhì)的干擾,實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的定性和定量分析[17-20]。固相萃取法(solid-phase extraction,SPE)是21世紀(jì)以來(lái)蓬勃興起的樣品前處理技術(shù),可使分離、純化與濃縮同步完成,常被用于多甲氧基類(lèi)黃酮等柑橘中的有效成分在動(dòng)物體內(nèi)的代謝研究[21-23]。
因此,本研究采用SPE法提取生物樣品,純化后通過(guò)UHPLC-Q-Exactive MS技術(shù)分析桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,以期剖析其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程。
Thermo Fisher Ultimate 3000超高效液相色譜儀和Q-Exactive質(zhì)譜(美國(guó)Thermo Fisher公司),配有電噴霧離子源(ESI);Xcalibur 2.1工作站;R200D分子天平(十萬(wàn)分之一,德國(guó)Sartorius公司);Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);OASIS HLB C18固相萃取小柱(3 L/60 g,美國(guó)Waters公司)。
桔紅素對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號(hào)MUST-18012910);乙腈和甲醇(質(zhì)譜級(jí),美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(色譜級(jí),德國(guó)Merck公司)。
SPF級(jí)SD大鼠(雄性,200~220 g),購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011。本研究由北京市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2015-0033。
稱(chēng)取桔紅素對(duì)照品480 mg,溶解于16 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中。
色譜柱為Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫25 ℃;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B);梯度洗脫:0~1 min,5% B;1~3 min,5%~25% B;3~8 min,25%~60% B;8~15 min,60%~80% B;15~20 min,80%~100% B;20~24 min,100% B;24~25 min,100%~5% B;25~30 min,5% B;體積流量為0.30 mL/min;進(jìn)樣量為2 μL。
電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式,毛細(xì)管溫度350 ℃,鞘氣(sheath gas)體積流量275 kPa,輔助氣(aux gas)體積流量138 kPa,噴霧電壓(source voltage)4 kV。碰撞能量(collision energy)40 eV。檢測(cè)方式為Full MS/dd-MS2,F(xiàn)ull MS分辨率70 000,dd-MS2分辨率17 500,質(zhì)量掃描范圍m/z100~1500。
將16只SD大鼠隨機(jī)分為空白組與給藥組,實(shí)驗(yàn)前于SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(室溫22~26 ℃,濕度40%~70%,12 h晝夜更替),喂藥前禁食12 h,全程不禁水。
給藥組以300 mg/kg的劑量ig給予桔紅素溶液,空白組則ig等量的0.5%的羧甲基纖維素鈉。
待空白組與給藥組大鼠給藥完成后,置于代謝籠中,分別于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h眼內(nèi)眥取血約0.5 mL置于肝素鈉抗凝EP管中,靜置15 min,于4 ℃下3000 r/min離心15 min,合并上述5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上清液,將空白組與給藥組血漿分裝保存(-80 ℃)。分別收集其24 h內(nèi)排出的尿液與糞便,尿液于4 ℃下3000 r/min離心15 min,收集上清液分裝(-80 ℃)。糞便烘干后研磨粉碎,分別稱(chēng)取2組糞便粉末各0.5 g,溶解于70%的乙醇中,超聲提取30 min,收集溶液層保存(-80 ℃)。
將固相萃取小柱用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化平衡,分別取解凍后的生物樣品(血漿、尿液與糞便)各1 mL加入柱中,依次用5 mL去離子水和3 mL甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液,室溫下用氮?dú)獯蹈?,得到的殘?jiān)?00 μL初始比例流動(dòng)相(5%乙腈溶液)復(fù)溶,渦旋震蕩3 min,13 000 r/min離心15 min(4 ℃),收集上清液進(jìn)行UHPLC- HRMS分析。
在正離子掃描模式下,桔紅素產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z373.127 62,分子式為C20H21O7(誤差為-1.50 ×10-6)。在其ESI-MS2質(zhì)譜圖中,檢測(cè)到的主要二級(jí)碎片離子有m/z358 [M-CH3]+、m/z343 [M-2CH3]+、m/z312 [M-2CH3-OCH3]+、m/z327 [MCH3-OCH3]+、m/z297 [M-3CH3-OCH3]+以及m/z345 [M-CO]+。通過(guò)對(duì)比黃酮類(lèi)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律[24-25],本研究以連續(xù)丟失CH3與OCH3、中性丟失CO作為此類(lèi)化合物的在ESI正離子模式下的特異性裂解規(guī)律,以為下一步的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)篩選與鑒定提供依據(jù)。桔紅素在正離子模式下的多級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1,其詳細(xì)裂解途徑見(jiàn)圖2。
圖1 桔紅素在正離子掃描模式下的多級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Multi-level mass spectrum of tangeretin in positive ion scanning mode
圖2 桔紅素對(duì)照品在正離子模式下的裂解途徑Figure 2 Cleavage pathway of tangeretin in positive ion mode
基于UHPLC-Q-Exactive高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析大鼠給藥后的尿液、血漿與糞便,通過(guò)對(duì)比空白組與給藥組的生物樣品色譜圖,結(jié)合桔紅素對(duì)照品的質(zhì)譜碎裂規(guī)律、二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片、保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量以及脂水分配系數(shù)(calculated logP,ClogP),最終鑒定出包括原型在內(nèi)的28個(gè)代謝產(chǎn)物,其中尿液中有18個(gè)、血漿中有22個(gè)、糞便中有26個(gè)。鑒定結(jié)果見(jiàn)表1??瞻捉M與給藥組的血漿、尿液與糞便的總離子流圖見(jiàn)圖3。
圖3 大鼠生物樣品的總離子流圖譜Fig.3 Total ion chromatograms of biological samples from rats
表1 大鼠尿液、血漿和糞便中的代謝產(chǎn)物Table 1 Summary of tangeretin metabolites in rat urine, plasma and feces
在正離子掃描模式下,代謝產(chǎn)物M0的色譜保留時(shí)間為9.71 min,精確相對(duì)分子質(zhì)量為373.127 66,其質(zhì)譜碎裂行為與桔紅素對(duì)照品類(lèi)似,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[26-27],可將其準(zhǔn)確鑒定為桔紅素?;衔颩13、M19、M23以及M24在正離子模式下均產(chǎn)生m/z為359.112 48的準(zhǔn)分子離子峰,較之桔紅素少14(丟失了1分子CH2),由精確相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)出它們的分子式都為C19H19O7,在ESI-MS2裂解過(guò)程中,它們都產(chǎn)生了m/z344(脫去1分子CH3)、m/z329(脫去2分子CH3)以及m/z311(脫去1分子H2O)的碎片離子,據(jù)此推斷它們都是桔紅素的去甲基化產(chǎn)物。根據(jù)反相色譜的洗脫行為,ClogP值越大的化合物越難被洗脫。因此代謝產(chǎn)物M13、M19、M23和M24分別為5,6,7,8-四甲氧基-4′-羥基黃酮(ClogP,1.80),5,6,7,4′-四甲氧基-8-羥基黃酮(ClogP,2.13),5,6,8,4′-四甲氧基-7-羥基黃酮或5,7,8,4′-四甲氧基-6-羥基黃酮(ClogP,2.23),6,7,8,4′-四甲氧基-5-羥基黃酮(ClogP,3.03)。
代謝產(chǎn)物M11、M18和M27均產(chǎn)生m/z375.107 43的準(zhǔn)分子離子峰 [M+H]+,推測(cè)分子式為C19H19O8,其相對(duì)分子質(zhì)量比M13、M19、M23以及M24多16,推測(cè)為它們的羥基化產(chǎn)物。在它們的二級(jí)質(zhì)譜圖中都存在m/z345(丟失2分子CH3)、m/z327(失去1分子H2O)和m/z299(中性丟失1分子CO)等離子碎片,因此M11、M18和M27為桔紅素發(fā)生去甲基化反應(yīng)后的羥基化產(chǎn)物。
化合物M8在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z535.144 63,推測(cè)分子式為C25H27O13,其相對(duì)分子質(zhì)量比M13多176,推測(cè)為M13、M19、M23以及M24的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。在其ESI-MS2裂解過(guò)程中檢測(cè)到m/z359(丟失1分子葡萄糖醛酸)以及m/z344、329、311等碎片離子,進(jìn)一步證明其與M13的碎裂行為相似,因此可將M8鑒定為桔紅素去甲基化和葡萄糖醛酸化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。同理,M6的相對(duì)分子質(zhì)量551.139 54比M11、M18及M27多176,二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z375是由m/z551中性丟失1分子葡萄糖醛酸產(chǎn)生的,又根據(jù)m/z360、345、327等特征碎片將M6鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。
代謝產(chǎn)物M16的準(zhǔn)分子離子峰為m/z439.069 33[M+H]+,推測(cè)分子式為C19H19O10S(誤差為-1.47×10-6),比去甲基化桔紅素的理論相對(duì)分子質(zhì)量多80,推測(cè)為桔紅素去甲基化和硫酸酯化反應(yīng)產(chǎn)物。而之后連續(xù)丟失CH3以及中性丟失1分子水(分別產(chǎn)生m/z344, 329, 311)進(jìn)一步證實(shí)了上述推斷。與之相似,化合物M12(C19H19O11S)被鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和硫酸酯化產(chǎn)物。
化合物M1、M3、M9、M15、M17和M25均產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z345.096 98 [M+H]+,推測(cè)其分子式為C18H17O7,分子質(zhì)量比桔紅素少28,推測(cè)為桔紅素雙去甲基化產(chǎn)物。在二級(jí)裂解過(guò)程中檢測(cè)到m/z345、315、330等特征碎片,證明它們的裂解規(guī)律與桔紅素類(lèi)成分一致[28-29],故將它們鑒定為桔紅素雙去甲基化反應(yīng)產(chǎn)物(失去了2分子CH2)。而代謝物M5、M7及M22均產(chǎn)生m/z361.091 88的準(zhǔn)分子離子峰,由Xcalibur推測(cè)分子式為C18H17O8,相對(duì)分子質(zhì)量較M1多16,推測(cè)為M1類(lèi)同分異構(gòu)體的羥基化產(chǎn)物。在ESI-MS2質(zhì)譜碎裂中,m/z361、346、331、328及300等特征離子表明其裂解行為與M1等化合物類(lèi)似,因此將M5、M7及M22鑒定為桔紅素雙去甲基化和羥基化產(chǎn)物。
在正離子掃描模式下,代謝產(chǎn)物M4產(chǎn)生m/z331.081 38,分子式為C17H15O7的準(zhǔn)分子離子峰(誤差為-1.63×10-6)。其實(shí)驗(yàn)相對(duì)分子質(zhì)量較之桔紅素少42,推測(cè)是由桔紅素發(fā)生三去甲基化反應(yīng)生成的。M4主要的二級(jí)碎片離子m/z316和m/z301分別是由m/z331連續(xù)丟失CH3基團(tuán)所產(chǎn)生,而m/z298進(jìn)一步反映其裂解行為與化合物M1、M13等相似,故將M4鑒定為桔紅素三去甲基化產(chǎn)物。與M5、M11的鑒定方式相同,可將分子式為C17H15O8的M2和M14鑒定為桔紅素三去甲基化與羥基化復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。
化合物M20和M21的準(zhǔn)分子離子峰均為m/z389.123 08 [M+H]+,推測(cè)分子式為C20H21O8,比正離子模式下檢測(cè)到的桔紅素(C20H21O7)多了1個(gè)氧原子,推測(cè)為桔紅素發(fā)生了羥基化反應(yīng)。在其二級(jí)質(zhì)譜圖中篩選得到的m/z374、359、341和313等離子碎片進(jìn)一步證實(shí)了上述推斷。代謝產(chǎn)物M26產(chǎn)生了m/z403.138 68和分子式為C21H23O8的準(zhǔn)分子離子峰(誤差為-2.37×10-6)。其相對(duì)分子質(zhì)量比桔紅素多30,推測(cè)桔紅素結(jié)構(gòu)中多了1個(gè)甲氧基(-OCH3)。在ESI-MS2質(zhì)譜圖中,m/z403經(jīng)碰撞誘導(dǎo)碎裂產(chǎn)生m/z388、373(連續(xù)丟失CH3)、m/z355(脫去1分子H2O)、m/z327(中性丟失CO),故將M26鑒定為桔紅素甲氧基化產(chǎn)物。其二級(jí)譜圖見(jiàn)圖4。
圖4 代謝物M26的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectrum of metabolite M26
代謝物M10在6.82 min被洗脫并產(chǎn)生m/z315.122 68的準(zhǔn)分子離子峰 [M+H]+,預(yù)測(cè)分子式為C18H19O5(誤差為-2.00×10-6)。其相對(duì)分子質(zhì)量比桔紅素少58,而二級(jí)譜圖中的特征碎片m/z133表明中性丟失了1分子CO,m/z297、279等產(chǎn)物離子證明其碎裂行為與桔紅素類(lèi)化合物相同,故推測(cè)桔紅素還脫去了1分子甲氧基(-OCH3)。因此將M10鑒定為桔紅素去甲氧基化和脫一氧化碳復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)物。其二級(jí)譜圖見(jiàn)圖5。
圖5 代謝物M10的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrum of metabolite M10
通過(guò)對(duì)比空白組大鼠的血漿、尿液與糞便質(zhì)譜圖,最終從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個(gè)代謝產(chǎn)物,其詳細(xì)代謝途徑見(jiàn)圖6。綜合分析這些代謝物的轉(zhuǎn)化途徑,桔紅素在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生去甲基化、羥基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化、去甲氧基化、甲氧基化、脫一氧化碳以及它們的復(fù)合反應(yīng)等。
圖6 桔紅素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin in rats
本研究采用固相萃取法處理大鼠的生物樣品(尿液、血漿與糞便),可高效提取其中的代謝產(chǎn)物,使有機(jī)溶劑的使用量大大減少、重復(fù)性得到進(jìn)一步優(yōu)化,且操作簡(jiǎn)便,避免了多種雜質(zhì)的干擾。生物樣品經(jīng)純化后,使用UHPLC-Q-Exactive高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大鼠體內(nèi)桔紅素的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了全面篩選與快速鑒定,基于桔紅素等多甲氧基類(lèi)黃酮對(duì)照品的特征性碎裂行為、通過(guò)化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量獲取分子式,使誤差縮小,鑒定結(jié)果更為精確。
結(jié)果表明,共從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個(gè)代謝產(chǎn)物。其中鑒定得到的M1、M3、M4及M13等代謝物最為常見(jiàn),而其后發(fā)生羥基化反應(yīng)生成的M2、M5與M11,發(fā)生硫酸酯化和葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成的M6、M8和M12進(jìn)一步剖析了桔紅素深層次的代謝輪廓。而M10(脫甲氧基與一氧化碳)與M26(甲氧基化)則對(duì)現(xiàn)有極少數(shù)有關(guān)桔紅素的代謝研究作了重要補(bǔ)充。本研究較為詳細(xì)地剖析了桔紅素這一類(lèi)多甲氧基黃酮的代謝機(jī)制和中間過(guò)程,可為桔紅素下一步的藥理活性、藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)研究及食品保健藥物的開(kāi)發(fā)提供參考,同時(shí)可為其他中藥天然有效成分的代謝研究提供借鑒。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突