傅馨瑩，楊仁義，孫正驥，李艷玲，龍清吟，李俊熙，吳 露，張 偉*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

2.瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）與血管內(nèi)膜下的脂質(zhì)蓄積及局部血管炎性反應(yīng)密切相關(guān)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）在血管內(nèi)膜下聚集，巨噬細胞吞噬ox-LDL形成的泡沫細胞不斷增多，釋放大量炎性因子，局部血管發(fā)生炎性反應(yīng)，促進脂質(zhì)蓄積和細胞泡沫化，最終形成粥樣斑塊。AS病變過程中，脂質(zhì)蓄積常伴有炎性反應(yīng)的發(fā)生[1]。《動脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》[2]指出，抗AS的關(guān)鍵在于早期干預(yù)血脂異常、肥胖、高血壓等危險因素，他汀類藥物能夠顯著降低低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平并升高高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，具有穩(wěn)定或消退粥樣斑塊的作用，可以降低心腦血管疾病發(fā)生率。他汀類藥物可以有效地調(diào)脂穩(wěn)斑，但其抑制血管炎性反應(yīng)作用較弱，目前臨床上尚無特異性針對動脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的有效藥物?！秳用}粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》規(guī)范了中西醫(yī)診療方案，將AS分為痰瘀互結(jié)、氣陰兩虛、氣虛血瘀、氣滯血瘀4證，面色淡白而乏力身倦，伴有氣虛懶言，痛如針刺，舌暗或紫斑，脈沉而澀者，可予以補陽還五湯治之[3]。補陽還五湯能夠降低斑塊內(nèi)巨噬細胞含量，抑制泡沫細胞形成[4]；抑制斑塊中脂質(zhì)蓄積及炎性因子分泌，抑制炎性反應(yīng)，加速脂質(zhì)代謝[5]。

課題組前期研究表明，補陽還五湯苷類組分具有抑制炎性因子表達、減少炎性因子生成的作用[6-7]；補陽還五湯苷類組分可以抑制血管內(nèi)膜增生，具有修復(fù)內(nèi)皮的作用，可能與調(diào)節(jié)血脂水平、改善局部微環(huán)境有關(guān)[8]，但補陽還五湯苷類組分抗炎及調(diào)血脂的作用機制尚不明確。近年來，中西醫(yī)結(jié)合治療模式展現(xiàn)出協(xié)同增益效用，基于此推測補陽還五湯苷類組分與阿托伐他汀在治療AS炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝上具有協(xié)同作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析補陽還五湯苷類組分與阿托伐他汀治療AS的作用機制，從生物信息學(xué)角度挖掘出二者的潛在靶點及作用通路，并用體外實驗進行驗證，為中西醫(yī)結(jié)合抗AS奠定藥物基礎(chǔ)，為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化研究提供新方向。

1 方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）；中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）；String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）；WebGestalt數(shù)據(jù)庫（http://www.webgestalt.org/#）；DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.7.2軟件。

1.1.2 藥物作用靶點預(yù)測 將補陽還五湯苷類組分的主要成分黃芪甲苷、芍藥苷、苦杏仁苷及阿托伐他汀錄入PubChem數(shù)據(jù)庫，收集其化學(xué)結(jié)構(gòu)式；將各化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行預(yù)測，獲得作用靶點，整合4個成分作用靶點并去除重復(fù)值，獲得藥物相關(guān)作用靶點。

1.1.3 疾病相關(guān)靶點預(yù)測 以“atherosclerosis”“atherogenesis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM及TCMIP數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)靶點信息，整合3個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果并去除重復(fù)值，獲得疾病相關(guān)靶點。

1.1.4 藥物-疾病靶點篩選 取交集，獲得藥物活性成分與AS的共同靶點，繪制韋恩圖。

1.1.5 藥物-疾病靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將所得到的共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入Cytoscape，使PPI網(wǎng)路可視化。利用cytoHubba插件對共同靶點進行拓撲分析，選取富集于前20的靶點，得到網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.6 藥物-疾病共同靶點基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫，將共同靶點進行GO富集分析，分別導(dǎo)出生物過程（biological process，BP)、細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）富集分析數(shù)據(jù)，進行“加權(quán)集合覆蓋”分析；將共同靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行KEGG通路富集分析，利用Cytoscape軟件對前20的通路與該通路涉及靶點構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 SPF級雄性SD大鼠20只，5～6周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2019-000。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，晝夜交替各12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號LL2019102503）。

1.2.2 細胞 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞細胞庫。

1.2.3 藥材 補陽還五湯由黃芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、當(dāng)歸9 g、地龍9 g、紅花9 g、桃仁9 g組成，黃芪（批號190902）、赤芍（批號190701）、川芎（批號190902）、當(dāng)歸（批號190802）、地龍（批號191001）、紅花（批號190901）、桃仁（批號191101）購自湖南新匯醫(yī)藥有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院左亞杰教授鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根、毛茛科植物川赤芍PaeoniaveitchiiLynch.的根、傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的根莖、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels.的根尾、鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的去內(nèi)臟全體、菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的花、薔薇科植物桃AmygdaluspersieaLinn.的干燥成熟種子，均符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.2.4 藥品與試劑 阿托伐他汀片（批號H20133127，10 mg/片）購自浙江樂普藥業(yè)股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號PM150210）、特級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號164210-500）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；ox-LDL（批號YB-002）購自廣州奕源生物科技有限公司；CCK8試劑盒（批號BS350B）購自上海白鯊生物科技有限公司；油紅O染色液（批號G1262-4）購自北京索萊寶科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號分別為E-EL-M0049c、E-EL-M0044c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；細胞總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）試劑盒（批號分別為E1015-50、E1016-50）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號70-PQ0012）購自上海碧云天天生物科技有限公司；ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號GE2301-100）購自美國Genview公司；Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase-2，JAK2）抗體、磷酸化JAK2（p-JAK2）抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體、p-STAT3抗體（批號分別為ab108596、ab32101、ab68153、ab76315）購自英國Abcam公司；β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號分別為02536-1-AP、SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒（批號DP419）購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒（批號E047、E096）購自上海近岸科技有限公司；JAK2、STAT3、β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.5 儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；Cytation 3型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Heraeus Fresco 17型超速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；T100 Thermal Cycler qRT-PCR儀、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2.6 補陽還五湯的制備 補陽還五湯浸膏由湖南中藥研究所制備，取原方藥材，浸泡30 min后，加入12倍量水煎煮2 h，濾過；再加入10倍量水煎煮1.5 h，濾過；合并2次濾液，濃縮至100 mL，減壓干燥濃縮為干膏（21.32 g/付），不加輔料打磨成粉，密封備用。補陽還五湯浸膏稀釋后，經(jīng)大孔樹脂色譜、高效液相色譜等方法提取苷類組分浸膏（1.286 6 g/付）[9]。原方提取物和苷類組分提取物以高效液相色譜法進行質(zhì)控檢測，苷類組分中的黃芪甲苷、苦杏仁苷、芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.98、5.48、103.6 mg/g[10]。

1.2.7 含藥血清的制備 根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，SD大鼠隨機分為對照組、補陽還五湯（10.8 g/kg）組、苷類組分（0.64 g/kg）組和阿托伐他汀（0.9 mg/kg）組，每組5只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，2次/d，連續(xù)7次。于末次給藥2 h后，大鼠ip 10%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，取血后脫頸椎處死。全血3000 r/min離心15 min，取上層血清，分別得到空白血清、補陽還五湯血清、苷類組分血清及阿托伐他汀血清，于恒溫水浴鍋56 ℃滅活30 min，濾過分裝，于-80 ℃保存。

1.2.8 ox-LDL對RAW264.7細胞存活率的影響 取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以1×105/孔接種于96孔板，待細胞貼壁。設(shè)置對照組和ox-LDL（25、50、75、100、125 μg/mL）組，各給藥組加入相應(yīng)溶液，對照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、3、6、12、24、48 h，加入CCK8試劑，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對照－A空白)

1.2.9 ox-LDL對RAW264.7細胞泡沫化的影響 在確定對RAW264.7細胞活力無影響的ox-LDL質(zhì)量濃度范圍（0～100 μg/mL）及刺激時間（0～24 h）后，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以2.5×105/孔接種于放有細胞爬片的24孔板中，待細胞貼壁。加入ox-LDL（50 μg/mL），分別培養(yǎng)0、3、6、12、24 h，以確定ox-LDL對RAW264.7細胞泡沫化的合適時間；加入含不同質(zhì)量濃度ox-LDL（0、25、50、75、100 μg/mL）的10% FBS DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，以確定ox-LDL對RAW264.7細胞泡沫化的合適質(zhì)量濃度。取出細胞，按試劑盒說明書進行染色，甘油封片。染色后細胞內(nèi)可見明顯紅色脂質(zhì)顆粒。

1.2.10 CCK8法確定含藥血清作用于RAW264.7細胞的濃度和時間 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以1×105/孔接種于96孔板，待細胞貼壁。設(shè)置對照組和空白血清（1%、5%、10%、15%、20%）組，空白血清組加入含不同濃度空白血清的DMEM培養(yǎng)基，對照組加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入CCK8試劑，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的A值，計算空白血清對細胞生長的抑制率，獲得無細胞毒性的含藥血清濃度。

細胞抑制率＝(A對照－A給藥)/(A對照－A空白)

1.2.11 細胞分組及干預(yù) 在確定造模條件后，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以1×106/孔接種于6孔板，待細胞貼壁。設(shè)置對照組、模型組、補陽還五湯（10%）組和苷類組分高、中、低劑量（10.0%、5.0%、2.5%）組及阿托伐他?。?0%）組。對照組和模型組加入10%空白血清，苷類組分高劑量組加入10%苷類組分血清，苷類組分中劑量組加入5%苷類組分血清和5%空白血清，苷類組分低劑量組加入2.5%苷類組分血清和7.5%空白血清，補陽還五湯組和阿托伐他汀組分別加入10%補陽還五湯血清及10%阿托伐他汀血清，預(yù)處理3 h；再加入含ox-LDL（75 μg/mL）的含藥或空白血清的DMEM培養(yǎng)基干預(yù)24 h。

1.2.12 含藥血清對RAW264.7細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響 按“1.2.11”項下方法處理細胞和分組，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入裂解液反應(yīng)10 min，離心取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按試劑盒說明書測定各組細胞內(nèi)TC及FC含量，膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）為TC與FC的差值，CE/TC＞50%為泡沫細胞模型的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2.13 含藥血清對RAW264.7細胞泡沫化程度的影響 按“1.2.11”項下方法處理細胞和分組，進行油紅O染色，于顯微鏡下隨機觀察6個不重合的視野，取細胞內(nèi)含有5個以上較大紅色染料顆粒作為泡沫細胞形成的標(biāo)準(zhǔn)[12]，計數(shù)泡沫化細胞并計算泡沫細胞陽性率。

泡沫細胞陽性率=泡沫細胞數(shù)/細胞總數(shù)

1.2.14 ELISA檢測含藥血清對RAW264.7細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響 按“1.2.11”項下方法處理細胞和分組，吸取上清，離心，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書測定細胞上清液中TNF-α和IL-6水平。

1.2.15 Western blotting檢測含藥血清對RAW264.7細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響 按“1.2.11”項下方法處理細胞和分組，收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉90 min，分別加入β-actin（1∶6000）、JAK2（1∶2000）、p-JAK2（1∶2000）、STAT3（1∶2000）和p-STAT3（1∶2000）抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶6000），37 ℃孵育60 min；采用ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并用Image Lab 4.0軟件進行定量分析。

1.2.16 qRT-PCR檢測含藥血清對RAW264.7細胞JAK2和STAT3mRNA表達的影響 按“1.2.11”項下方法處理細胞和分組，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：JAK2上游引物5’-CGCTCAGACAGTATCATCT-3’，下游引物5’-CTCCAACTTCTCTTCTTACAC-3’；STAT3上游引物5’-AGGACATCAGTGGCAAGA-3’，下游引物5’-AGGTAGACAAGTGGAGACA-3’；β-actin上游引物5’-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3’，下游引物5’-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料以±s表示，組間比較若符合正態(tài)性且方差齊性時，采用單因素方差分析LSD法進行兩兩比較；方差不齊時，采用Tamhane’sT2法進行兩兩比較；若不符合正態(tài)性時，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 藥物抗AS靶點預(yù)測 通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲得藥物主要成分相關(guān)作用靶點163個，其中黃芪甲苷26個、芍藥苷24個、苦杏仁苷38個、阿托伐他汀100個。通過GeneCards、OMIM及TCMIP得到疾病相關(guān)作用靶點1165個。通過Bioinformatics Gent數(shù)據(jù)庫取交集，獲得藥物-疾病共同靶點65個，韋恩圖見圖1。

2.1.2 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件，獲得有63個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。用CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析，得到富集于前20靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。度值、緊密度、介數(shù)從高到低的前5位為相同靶點，依次為TNF、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）、STAT3、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3），表明這些靶點在整個網(wǎng)絡(luò)中影響能力大，受其他靶點的影響小，在治療AS中發(fā)揮重要的作用。

圖2 “藥物-疾病”靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of “drug-disease” targets

圖3 度值 (A)、緊密度 (B) 和介數(shù) (C) 拓撲分析圖Fig.3 Topology analysis diagram of degree (A), closeness (B) and betweenness (C)

2.1.3 GO和KEGG通路富集分析 通過WebGestalt數(shù)據(jù)庫，獲得GO富集分析結(jié)果，其中BP分析結(jié)果260個、CC分析結(jié)果2個、MF分析結(jié)果17個。GO富集分析顯示，共同靶點主要分布于細胞外基質(zhì)、膜區(qū)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)肽酶、磷脂酰肌醇激酶等活性以及與磷酸酶、糖胺聚糖、脂多糖、細胞因子受體等結(jié)合的方式，參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細胞遷移、肌細胞增殖、脂質(zhì)定位、傳導(dǎo)細胞內(nèi)受體信號等生物過程。通過DAVID數(shù)據(jù)庫，獲得KEGG通路富集分析結(jié)果，共富集78條通路，“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)見圖4，藥物主要通過參與HIF-1、JAK/STAT、Rap1、VEGF等信號通路治療AS。

圖4 “靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 “Target-pathway” network

2.2 實驗驗證

結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，為進一步探討補陽還五湯苷類組分與阿托伐他汀在治療AS的作用，本研究基于JAK2/STAT3信號通路，以炎性反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常為切入點，在RAW264.7細胞泡沫化模型中研究聯(lián)合用藥對脂質(zhì)含量、泡沫化程度及炎性因子的影響，為中西醫(yī)結(jié)合治療AS的協(xié)同增益效用提供實驗基礎(chǔ)。

2.2.1 ox-LDL對RAW264.7細胞活力的影響 如表1所示，與對照組比較，ox-LDL（125 μg/mL）作用于RAW264.7細胞3、6、12、48 h均顯著降低細胞活力（P＜0.05、0.01），抑制細胞增殖；ox-LDL（50、75、100 μg/mL）作用于RAW264.7細胞48 h顯著降低細胞活力（P＜0.05、0.01）。ox-LDL（0～100 μg/mL）作用于RAW264.7細胞0～24 h，細胞活力無明顯影響。

表1 ox-LDL對RAW264.7細胞活力的影響 (±s , n=6)Table 1 Effect of ox-LDL on viability of RAW264.7 cells (±s , n=6)

表1 ox-LDL對RAW264.7細胞活力的影響 (±s , n=6)Table 1 Effect of ox-LDL on viability of RAW264.7 cells (±s , n=6)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs control group

組別 劑量/(μg·mL-1) 細胞存活率/%0 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照 — 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 ox-LDL 25 100.00 98.29±8.65 99.51±12.05 114.26±12.14# 105.22±6.45 105.76±5.79 50 100.00 101.03±9.54 99.22±7.23 95.65±10.62 105.31±7.46 91.40±2.12#75 100.00 96.91±5.36 95.16±6.55 94.85±7.04 101.63±5.87 70.59±5.99##100 100.00 92.86±10.61 94.70±10.88 93.51±6.00 100.24±3.94 58.96±2.32##125 100.00 91.66±7.54# 93.75±3.32# 83.68±6.31## 94.45±3.86 28.70±10.75##

2.2.2 ox-LDL對RAW264.7細胞泡沫化的影響 細胞吞噬ox-LDL后，細胞內(nèi)脂質(zhì)大量積聚形成泡沫細胞，為了確定ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細胞泡沫化的最佳時間和最佳質(zhì)量濃度，通過油紅O染色檢測ox-LDL干預(yù)后RAW264.7細胞泡沫化程度。如圖5所示，與對照組相比，ox-LDL（50 μg/mL）作用于細胞后，胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增多，泡沫化程度逐漸增加，呈時間相關(guān)性。如圖6所示，隨著ox-LDL質(zhì)量濃度的增加，細胞泡沫化程度逐漸增強；當(dāng)ox-LDL質(zhì)量濃度為75 μg/mL時，細胞內(nèi)有大量脂質(zhì)存在，細胞體積增大，多呈圓形，泡沫化程度較高，其后泡沫化程度未見明顯增高。由此確定以ox-LDL（75 μg/mL）刺激RAW264.7細胞24 h為造模條件。

圖5 ox-LDL (50 μg/mL) 對RAW264.7細胞泡沫化的影響 (×200)Fig.5 Effect of ox-LDL (50 μg/mL) on foaming of RAW264.7 cells (× 200)

圖6 ox-LDL對RAW264.7細胞泡沫化的影響 (×200)Fig.6 Effect of ox-LDL on foaming of RAW264.7 cells (× 200)

2.2.3 空白血清的細胞毒性實驗 如圖7所示，與對照組比較，血清濃度為1%、5%、15%、20%時，對細胞有明顯的抑制作用（P＜0.05、0.01）。因此，選取10%血清濃度為無細胞毒性的血清濃度。

2.2.4 含藥血清對RAW264.7細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響 如圖8所示，與對照組相比，模型組細胞內(nèi)TC、FC、CE含量和CE/TC值明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，補陽還五湯、苷類組分高、低劑量組以及阿托伐他汀組細胞內(nèi)TC、FC、CE含量顯著降低（P＜0.01），苷類組分中劑量組細胞內(nèi)TC、CE含量顯著降低（P＜0.01），苷類組分高、中劑量組以及阿托伐他汀組細胞內(nèi)CE/TC值顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖 7 空白血清對 RAW264.7細胞抑制率的影響(±s , n=6)Fig.7 Effect of blank serum on inhibition rate of RAW264.7 cells (±s , n=6)

圖8 含藥血清對RAW264.7細胞內(nèi)TC、FC、CE含量及CE/TC的影響 (±s , n=6)Fig.8 Effect of blank serum on contents of TC, FC, CE and CE/TC in RAW264.7 cells (±s , n=6)

2.2.5 含藥血清對RAW264.7細胞泡沫化程度的影響 如圖9和表2所示，對照組細胞形態(tài)多呈梭形，細胞內(nèi)無明顯脂質(zhì)聚集，泡沫化細胞少。與對照組相比，模型組細胞多呈圓形，體積有明顯的增大，胞內(nèi)大量脂質(zhì)積聚，泡沫化細胞顯著增多（P＜0.01）。與模型組相比，補陽還五湯組、苷類組分中劑量組細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚減少，泡沫化細胞顯著減少（P＜0.05）；阿托伐他汀組細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚顯著減少，泡沫化細胞顯著減少（P＜0.01）；苷類組分高、低劑量組細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚減少。

表2 油紅O染色泡沫化細胞相對含量Table 2 Relative content of foamed cells stained with oil red O

圖9 含藥血清對ox-LDL干預(yù)的RAW264.7細胞泡沫化的影響 (×400)Fig.9 Effect of drug-containing serum on foaming of RAW264.7 cells intervened by ox-LDL (× 400)

2.2.6 含藥血清對RAW264.7細胞炎性因子分泌的影響 如圖10所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中TNF-α和IL-6水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組上清液中TNF-α和IL-6水平顯著降低（P＜0.01）。

圖10 含藥血清對RAW264.7細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響 (±s , n=6)Fig.10 Effect of drug-containing serum on levels of TNF-α and IL-6 in supernatant of RAW264.7 cells (±s , n=6)

2.2.7 含藥血清對RAW264.7細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響 如圖11所示，與對照組比較，模型組細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖11 含藥血清對RAW264.7細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響 (±s , n=5)Fig.11 Effect of drug-containing serum on expressions of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 in RAW264.7 cells(±s , n=5)

2.2.8 含藥血清對RAW264.7細胞JAK2和STAT3mRNA表達的影響 如圖12所示，與對照組相比，模型組細胞JAK2和STAT3mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞JAK2和STAT3mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖12 含藥血清對RAW264.7細胞JAK2和STAT3 mRNA表達的影響 (±s , n=5)Fig.12 Effect of drug-containing serum on mRNA expressions of JAK2 and STAT3 in RAW264.7 cells(±s , n=5)

3 討論

AS是導(dǎo)致腦梗死、心肌梗死、冠心病等多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，腦動脈、主動脈、冠狀動脈及外周動脈的血管病變是AS的始動因素，主要特征是泡沫細胞的形成、脂質(zhì)蓄積和局部血管炎性反應(yīng)的發(fā)生。補陽還五湯及苷類組分（苦杏仁苷、芍藥苷、黃芪甲苷）具有抗腦缺血、抗血管內(nèi)膜增生、抗血管平滑肌增殖等作用[8,10,13-15]；Liu等[3]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能夠通過多組分激活NF-κB通路，抑制IL-6和TNF-α表達，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善血管內(nèi)膜，從而發(fā)揮抗AS作用。因此，補陽還五湯或其有效組分與阿托伐他汀聯(lián)用可能具有較好的抗AS作用，其作用機制可能與抗炎、調(diào)脂穩(wěn)斑的雙重作用有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯苷類有效組分能夠抑制增生內(nèi)膜中細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成，上調(diào)增生血管內(nèi)膜I型膠原（collagen-I，Col-I）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達，促進ECM降解，發(fā)揮抗AS血管內(nèi)膜增生的作用?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究補陽還五湯主要苷類有效組分與阿托伐他汀治療AS的潛在作用機制，結(jié)果顯示，補陽還五湯苷類主要組分與阿托伐他汀能夠調(diào)控AKT1、VEGFA、STAT3、CASP3等65個靶點，介導(dǎo)JAK/STAT、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、TNF等78條信號通路，在ECM或膜區(qū)，參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細胞遷移、肌細胞增殖、脂質(zhì)定位等17個生物過程，從而治療AS。本研究從生物信息學(xué)角度初步證實了補陽還五湯苷類有效組分與阿托伐他汀能夠通過多靶點、多通路協(xié)同抗AS，其作用機制可能與調(diào)控JAK/STAT通路、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及脂質(zhì)代謝異常有關(guān)，為進一步實驗驗證提供了理論基礎(chǔ)和研究方向。

本研究進一步采用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細胞泡沫化，從細胞活力、細胞泡沫化等方面，選取10%血清濃度為無細胞毒性的血清濃度，以75 μg/mL ox-LDL刺激RAW264.7細胞24 h為最佳模型，與Cao等[16]用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細胞構(gòu)建的AS模型一致。結(jié)果顯示，各給藥組均能夠減少細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，降低泡沫化細胞數(shù)量，抑制RAW264.7細胞吞噬脂質(zhì)，顯著減少細胞內(nèi)TC、FC、CE含量，補陽還五湯苷類組分中劑量組與阿托伐他汀組療效相當(dāng)，提示在調(diào)節(jié)脂質(zhì)方面，中劑量補陽還五湯苷類組分與阿托伐他汀聯(lián)合用藥，可以協(xié)同發(fā)揮調(diào)脂穩(wěn)斑的作用。各給藥組均能夠抑制TNF-α和IL-6分泌，補陽還五湯抗炎作用最佳，其次為中劑量補陽還五湯苷類組分，提示在抗炎方面，苷類組分可能為補陽還五湯的主要藥效物質(zhì)，可以作為補陽還五湯原方的精準(zhǔn)有效組分替代藥物發(fā)揮抗炎作用。各給藥組均能夠抑制JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白及mRNA表達水平，提示補陽還五湯及其苷類有效組分能夠通過抑制JAK2/STAT3信號通路，在AS進程中發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)脂質(zhì)的作用。

綜上所述，取10%血清濃度為無細胞毒性的血清濃度，以75 μg/mL ox-LDL刺激RAW264.7細胞24 h能較好地模擬AS疾病模型；補陽還五湯苷類有效組分與阿托伐他汀能夠通過多靶點、多通路協(xié)同抗AS，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路，降低細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及TC、FC、CE含量，抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌有關(guān)；適宜劑量的苷類組分調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面與阿托伐他汀相當(dāng)，且抗炎作用優(yōu)于阿托伐他汀，提示苷類組分有望成為抗AS的有效藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突