紀(jì)梅芳,許惠春

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361000)

原發(fā)性肝癌在臨床被診斷時(shí)多數(shù)患者處于中晚期,失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[1]。因此,發(fā)現(xiàn)對(duì)人體正常組織損傷小的有效藥物已成為肝癌治療的關(guān)鍵。細(xì)胞自噬是在能量貧乏、外界刺激等壓力下,為了維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),機(jī)體通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)變性、損傷、衰老的細(xì)胞器回收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需要和細(xì)胞器的更新。細(xì)胞自噬一方面促進(jìn)細(xì)胞死亡,另一方面能夠促進(jìn)細(xì)胞的存活。大多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為自噬可抑制腫瘤的形成[2-3]。在腫瘤早期,自噬能限制腫瘤中的壞死與炎癥,從而間接抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此,對(duì)于細(xì)胞自噬的相關(guān)研究,有助于深入了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制,指導(dǎo)臨床診療。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要成分,其成分中藥理活性最大的即柴胡皂苷D(SSD)[4]。其可以調(diào)節(jié)免疫因子,對(duì)于抗炎、抗病毒、護(hù)肝等均有顯著作用,毒副作用小[5-6]。本文目的在探討柴胡皂甙D(SSD)對(duì)人肝癌細(xì)胞自噬水平的影響,為肝癌治療提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 研究材料

人肝癌細(xì)胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721以及Huh7均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

所有細(xì)胞分三組,對(duì)照組、SSD組、SSD+自噬抑制劑3-MA組。對(duì)照組不做任何處理。SSD組的細(xì)胞采用20 mM的SSD處理48小時(shí)。SSD+自噬抑制劑3-MA組的細(xì)胞同時(shí)采用20 mM的SSD和10 mM 的3-MA處理48小時(shí)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)SSD對(duì)于肝癌細(xì)胞體外增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將其置于37°C和5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第二天,從培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基,向培養(yǎng)基100μL中添加20 mM SSD。常規(guī)培養(yǎng)72小時(shí)后,向每個(gè)培養(yǎng)皿中添加20μL MTT(5 mg/mL)。常規(guī)培養(yǎng)4小時(shí)后,加入150μL二甲基亞砜溶液以吸收上清液,并在無(wú)光條件下休克10分鐘。將96孔培養(yǎng)板置于微孔板讀取器中,檢測(cè)每個(gè)孔在490 nm處的吸光度值。

1.2.3 克隆形成試驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細(xì)胞懸浮液。以1×103細(xì)胞/孔的密度,將細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并在37℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第二天,從孔中取出培養(yǎng)基,并向培養(yǎng)基中添加20 mM SSD 100μL。常規(guī)培養(yǎng)持續(xù)2周,每3天更換一次液體。將培養(yǎng)基從孔中吸出,用4%多聚甲醛固定15分鐘,用0.1%結(jié)晶紫染色5分鐘。用去離子水沖洗后,用數(shù)碼相機(jī)記錄細(xì)胞克隆,并進(jìn)行定量(Bio-RAD),克隆形成率(%)=藥物處理組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7常規(guī)消化、離心并重新懸浮以制備單細(xì)胞懸浮液。以2×105細(xì)胞/孔的密度,將細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并在37℃的5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第二天,更換含有20 mM SSD的培養(yǎng)基,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心,并在常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后收集。用PBS洗滌細(xì)胞兩次,然后用250μL的結(jié)合緩沖液懸浮,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106細(xì)胞/mL。

1.2.5 肝癌細(xì)胞p-AKT、p-AMPK、LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

加熱融化試劑盒三種試劑,在冰上充分混合。血漿蛋白提取的適宜試驗(yàn)劑量；加入PMSF(1∶10)。在最初的5分鐘內(nèi),PMSF增加了核蛋白提取試劑的用量。用EDTA溶液消化PBS 6cm培養(yǎng)皿(90%密度)中的細(xì)胞,并將細(xì)胞吹倒。離心速度為12000 RPM,離心管控制幾分鐘。每52μL細(xì)胞用PMSF細(xì)胞質(zhì)試劑沉淀520μL,最大速度和嚴(yán)重電擊5秒,細(xì)胞沉淀完全懸浮和分散,冰浴10min；B高速下5秒最大振動(dòng)26μL,冰浴1分鐘,4℃下12000g離心5分鐘；立即排空預(yù)冷EP管(避免接觸從細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)中提取的沉淀物),以獲得。取等量樣品,與5份樣品X緩沖液混合,煮沸5分鐘,在冰水中快速冷卻。通過(guò)電泳分離10%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠,并將蛋白質(zhì)分離方法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。將聚偏氟乙烯薄膜浸入密封溶液中,并在室溫下密封1小時(shí)。取下封閉的PVDF膜,用小袋沖洗,并在4攝氏度的夜間溫度下培養(yǎng)。沖洗3次。將PVDF膜轉(zhuǎn)移到含有兩種電抗的小袋中,并在室溫下孵育。清洗三次后,將PVDF膜置于塑料膜上,取適量ECL試劑5分鐘,將凝膠成像分析儀置于成像系統(tǒng)中。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SSD抑制肝癌細(xì)胞的增殖

SSD干預(yù)48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,人類肝癌細(xì)胞PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞的活性分別下降(19.49±2.92)%、(45.41±7.95)%、(53.84±5.53)%和(64.04±4.36)%,差異顯著(P<0.05)。SSD+3-MA組細(xì)胞活性與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的活性,這種抑制是通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖1。

圖1 SSD抑制肝癌細(xì)胞的增殖

2.2 SSD抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成

SSD處理2周后,與對(duì)照組相比,人類肝癌細(xì)胞PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞克隆數(shù)分別減少(57.11±6.55)%、(47.23±5.15)%、(51.45±5.56)%和(45.45±6.75)%(P<0.05)。SSD+3-MA組克隆數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD能顯著抑制HCC細(xì)胞的克隆形成,這種抑制是通過(guò)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖2。

圖2 SSD抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成

2.3 SSD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

數(shù)據(jù)顯示,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞的凋亡率分別為(11.67±1.17)%、(17.54±1.83)%、(15.45±1.55)%、(15.54±1.57)%,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。SSD+3-MA組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,這種誘導(dǎo)是通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖3。

2.4 SSD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中自噬小體的形成

經(jīng)過(guò)SSD處理后,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721以及Huh7的細(xì)胞中自噬小體大量增加。而對(duì)照組細(xì)胞和SSD+3-MA組的細(xì)胞的細(xì)胞并未出現(xiàn)自噬小體。見(jiàn)圖4。

圖4 SSD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中自噬小體的形成

2.5 SSD通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬

estern blot顯示,SSD處理后p-AKT不表達(dá),而p-AMPK蛋白表達(dá)增加。見(jiàn)圖5。

圖5 Western-blot條帶圖

3 討論

肝癌比較隱匿,發(fā)現(xiàn)確診時(shí)多為晚期,嚴(yán)重威脅人類生命健康[7-8]。柴胡在中醫(yī)中有著悠久的使用歷史,性微寒,有疏肝解郁、升陽(yáng)益氣之功效。柴胡中的SSD具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、保肝、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用,毒副作用小。SSD作為一種毒副作用小的中藥提取物,在原發(fā)性肝癌的防治方面取得了顯著的成就[9]。

本研究選擇人肝癌細(xì)胞系PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7作為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型,采用SSD進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示,SSD干預(yù)48小時(shí)后,細(xì)胞活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05),證實(shí)SSD在體外可以抑制這4個(gè)HCC細(xì)胞的增殖,這與SSD在其他腫瘤細(xì)胞中的結(jié)果一致[10]。此外,在加入自噬S抑制劑3-MA后,對(duì)照組和對(duì)照組之間的細(xì)胞活性沒(méi)有顯著差異(P>0.05),表明SSD的抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的。此外,本研究還進(jìn)一步研究了SSD對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成的影響。SSD治療2周后,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。這些結(jié)果表明,SSD能顯著抑制HCC細(xì)胞的克隆形成,而SSD+3-MA組的克隆形成數(shù)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),表明這種抑制是通過(guò)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)。

本研究顯示SSD組與對(duì)照組相比,PLC、MHCC-97H、SMMC-7721和Huh7細(xì)胞的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明,SSD在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面作用顯著,從而抑制肝癌細(xì)胞增值[11]。此外,SSD+3-MA組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組差異不明顯(P>0.05)。這些結(jié)果表明,SSD通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬來(lái)以致細(xì)胞凋亡。此外,本研究還通過(guò)電子顯微鏡研究了SSD對(duì)肝癌細(xì)胞自噬體的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組和SSD+3-MA組相比,SSD組自噬體數(shù)量顯著增加,提示SSD能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬。研究顯示[12]AMPK通過(guò)磷酸化自噬基因Beclin1的絲氨酸93、96位點(diǎn)從而影響VPS34的活性。本研究結(jié)果提示,SSD通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬。

綜上所述,SSD通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路而達(dá)成的來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,對(duì)肝癌的臨床治療有借鑒意義。