王 潔，廖 芬，田俊良

(六盤水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心 貴州 六盤水 553000)

1 引言

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，主要來自糞便，在44.5 ℃溫度下能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣[1]。六盤水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心一直采用多管發(fā)酵法進(jìn)行水質(zhì)中糞大腸菌群的測定，此方法精度高，但操做時(shí)間長，步驟較為繁瑣，需驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[2]，如果發(fā)酵管中存在其他種類的產(chǎn)氣菌，會(huì)致使檢測結(jié)果偏離[3]。本次實(shí)驗(yàn)是對多管發(fā)酵法與紙片快速法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對，對相同的實(shí)驗(yàn)樣品分別用此兩種方法進(jìn)行檢測和結(jié)果評價(jià)，比較兩種方法的有效性和可比性。

2 實(shí)驗(yàn)概況

2.1 材料與方法

多管發(fā)酵法：乳糖蛋白培養(yǎng)基、EC肉湯培養(yǎng)基。

紙片快速法：BD105 I水質(zhì)(糞)大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片、BD105Ⅱ水質(zhì)(糞)大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片。

2.2 儀器和設(shè)備

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(檢定溫度37 ℃)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(檢定溫度44.5 ℃)[4]、立式壓力蒸汽滅菌器

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1 多管發(fā)酵法

(1)水樣接種。嚴(yán)格按照國標(biāo)要求，將水樣充分混勻后根據(jù)試樣濃度確定接種量。每個(gè)樣品用3個(gè)不同的水樣量接種，同一水樣量接種5管。

(2)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，在37 ℃±0.5 ℃下培養(yǎng)24 h，產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明實(shí)驗(yàn)陽性。如在試管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，則輕拍試管，有小氣泡升起為陽性。

(3)復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。輕微震蕩初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用3 mm接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中。在44.5 ℃±0.5 ℃溫度下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后立即進(jìn)行結(jié)果判定[5]。

2.3.2 紙片快速法

每個(gè)樣品按3個(gè)10倍遞減的不同接種量接種，每個(gè)接種量分別接種5張紙片，共接種15張紙片。根據(jù)水樣污染程度確定接種量，盡可能使5個(gè)接種量最大的紙片為陽性、5個(gè)接種量最小的紙片為陰性，避免出現(xiàn)所有3個(gè)不同接種量共15張紙片全部為陽性或全部為陰性。接種后的試樣在44.5 ℃±0.5 ℃溫度下培養(yǎng)24 h后觀察，進(jìn)行結(jié)果判讀[6]。

2.3.3 對照實(shí)驗(yàn)

(1)空白對照。每一批次樣品均做一空白對照實(shí)驗(yàn)，用無菌水做全程序空白測定，兩種實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)后均不得有任何顏色反應(yīng)，否則該次樣品測定結(jié)果無效[7,8]。

(2)陽性及陰性對照。糞大腸菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產(chǎn)氣腸桿菌。上述標(biāo)準(zhǔn)菌株均制成濃度為300～3000個(gè)/mL的菌懸液，分別取相應(yīng)水量的菌懸液接種，陽性與陰性菌株各5份，與測試樣品一起培養(yǎng)。大腸埃希氏菌應(yīng)全部呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，產(chǎn)氣腸桿菌應(yīng)全部呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定[9]。

3 結(jié)果與分析

兩種方法比對實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果見表1。

糞大腸菌群檢測結(jié)果與平行雙樣測定結(jié)果對照試樣中的最可能數(shù)和95%置信限值進(jìn)行比對結(jié)果判定，若同一試樣檢測結(jié)果均在兩種檢測方法的95%置信限值內(nèi)，則比對成功，判定比對結(jié)果合格。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定詳見表2，平行雙樣結(jié)果判定詳見表3。

由空白及陰陽對照實(shí)驗(yàn)可知:陰性對照結(jié)果全陰性，證明實(shí)驗(yàn)環(huán)境、培養(yǎng)基、操作過程未受到污染，排除假陽性干擾；陽性對照結(jié)果全陽性，證明培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、檢測方法合適，能有效培養(yǎng)出目標(biāo)菌群；空白對照全部未檢出，排除實(shí)驗(yàn)用水的干擾。對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此次比對測試結(jié)果可信，具有參考價(jià)值[10]。

由數(shù)據(jù)可知，多管發(fā)酵法多個(gè)樣品存在測值略高于紙片快速法的情況，究其原因可能是測試樣品中存在其他種類的產(chǎn)氣菌，多管發(fā)酵法以產(chǎn)氣判定陽性，所以部分測試樣品值略高于紙片快速法。

表1 實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 糞大腸菌群實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

表3 糞大腸菌群平行雙樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

4 結(jié)論

在兩種測試實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置陽性菌株對照和陰性菌株對照，每一批次樣品均做一空白樣品對照，對實(shí)驗(yàn)全過程進(jìn)行質(zhì)量控制。通過在細(xì)菌室對12個(gè)受不同污染程度的水樣進(jìn)行方法比對實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：由輕度至重污染的水樣比對結(jié)果均合格，糞大腸菌群的測定由此兩種方法測定均適用。相比多管發(fā)酵法紙片快速法測定省去培養(yǎng)基配置與滅菌、接種復(fù)發(fā)酵環(huán)節(jié)，操作簡便，且培養(yǎng)時(shí)限比多管發(fā)酵法縮短24 h，更加方便快捷安全，更適用于水質(zhì)中糞大腸菌群的快速測定。