賈振華等
摘要:對(duì)檢測食品中大腸菌群快速檢測紙片法進(jìn)行研究。結(jié)果表明,經(jīng)過對(duì)培養(yǎng)基中顯色劑和冷水凝膠成分的優(yōu)化,培養(yǎng)基中氯化三苯四氮唑的濃度為0.4 mg/L時(shí),試紙片顯色效果最好,形成的菌落數(shù)較多;同時(shí)研究冷水凝膠對(duì)大腸菌群生長的影響,當(dāng)冷水凝膠濃度高于或低于0.7%時(shí),大腸菌群生長速度減慢。采用國標(biāo)法和紙片法檢測市售的8種食品,本試紙片法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果一致,紙片法的特異性和重復(fù)性較好。
關(guān)鍵詞: 大腸菌群;快速檢測;試紙片
中圖分類號(hào):Q93-332 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)17-4281-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.045
隨著人們生活水平的不斷提高,食品安全問題越來越受到人們的重視,微生物對(duì)食品的污染問題也相應(yīng)地備受關(guān)注。其中,大腸菌群檢測結(jié)果是判斷食品是否安全的重要指標(biāo)之一。大腸菌群并不是指某一特定細(xì)菌的名稱,而是對(duì)一大類細(xì)菌的概括名稱。它被定義為一群在37 ℃、24 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢的小桿菌[1]。它主要來源于人畜糞便,作為食品、水、藥品及化妝品等被糞便污染的標(biāo)志,已成為衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)的必檢項(xiàng)目。
目前,對(duì)于食品中大腸菌群的檢測大多采用國標(biāo)法,國標(biāo)法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、靈敏性均較高,但操作繁雜、耗時(shí)較長,不適用于快速檢測,對(duì)檢測人員業(yè)務(wù)水平要求也較高,同時(shí)不便于現(xiàn)場快速檢測。目前檢測大腸菌群較為先進(jìn)的方法有酶化學(xué)法、生物發(fā)光法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法等[3]。上述方法已被廣泛應(yīng)用,但也存在如滯后性嚴(yán)重、儀器成本高、專業(yè)要求高等不足。食品中大腸菌群的檢測要求準(zhǔn)確度高,及時(shí)性強(qiáng),因此急需操作簡單、快捷的檢測方法。而紙片法簡便易行,省去了繁瑣的操作流程。當(dāng)待檢樣品較多時(shí),選擇該法較合適,尤其是食品安全突發(fā)事件時(shí),可在短時(shí)間內(nèi)迅速對(duì)樣本進(jìn)行檢測,判斷樣本是否被大腸菌群污染。
本研究以濾紙片作為培養(yǎng)基和冷水凝膠的載體。培養(yǎng)基中含有氯化三苯四氮唑(TTC),在大腸菌群脫氫酶的作用下,TTC接受氫生成紅色而不溶于水的三苯甲胺使菌落呈現(xiàn)紅色;同時(shí),培養(yǎng)基中還添加了乳糖和酸堿指示劑,大腸菌群能分解乳糖產(chǎn)酸而使酸堿指示劑變色,菌落周圍產(chǎn)生黃圈。針對(duì)影響大腸菌群測試片質(zhì)量的多種因素開展研究,旨在研制快速簡便、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的測試片。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單增李斯特菌CMCC(B)54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志賀菌CMCC6120513、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028,均購于廣東省微生物研究所。
1.1.2 試劑 培養(yǎng)基配方:每升培養(yǎng)基中含胰蛋白胨15.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化納5.0 g、磷酸氫二鉀5.0 g、乳糖15.0 g,pH 6.3~6.5;冷水凝膠配方:質(zhì)量體積比為0.2%~0.4%聚丙烯酸鈉、0.1%~0.3%黃原膠、0.1%~0.2%卡拉膠和0.1%~0.2%魔芋膠;濾紙片為薄層層析濾紙。
1.1.3 檢測樣品來源 從武漢市部分超市、農(nóng)貿(mào)市場采集或購買樣品(牛奶、大白菜、蛋糕、啤酒、果汁、蜂蜜、鹵牛肉)共7份。
1.1.4 儀器設(shè)備 智能恒溫恒濕箱(Hst-250)。
1.2 方法
1.2.1 培養(yǎng)基配制 將培養(yǎng)基和冷水凝膠加入到去離子水中,定容至1 000 mL,在121 ℃滅菌15 min,再加入1.25 mL濃度為1 mg/mL脫氧膽酸鈉、8 mL 1.6%溴甲酚紫溶液、5 mL 0.8% TTC溶液,混勻后備用。
1.2.2 樣品制備 在無菌條件下,將25 g/mL樣品(固體樣品粉碎),放入裝有225 mL無菌生理鹽水和適量玻璃珠的500 mL燒杯中,經(jīng)充分振搖,依次無菌稀釋成10-1、10-2、10-3稀釋液。
1.2.3 紙片法制備 篩選白色、無毒、中速、密度均勻、吸附力合格的濾紙,將濾紙裁剪成合適的尺寸,通常為5.0 cm×5.0 cm。將濾紙片于121 ℃滅菌15 min。用無菌鑷子夾取濾紙浸泡在上述制備的培養(yǎng)基中浸泡2 h,拿出平放于托盤中,37 ℃烘干。分裝于已滅菌的聚丙烯塑料口袋內(nèi),密封備用。
1.2.4 樣品檢測 采用無菌操作將制備的樣品稀釋液取1 mL分別涂布于紙片上,每個(gè)稀釋液涂布 3個(gè),將涂布好的紙片放入無菌袋,置于培養(yǎng)箱中37 ℃,培養(yǎng)14~16 h。結(jié)果判定:紙片上出現(xiàn)紅色菌落,其周圍有黃圈者為陽性,根據(jù)測試上的紅色菌落數(shù)可以計(jì)算大腸菌群的濃度。
1.2.5 比對(duì)試驗(yàn) 采用大腸菌群國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法GB 4789.3-2010 與紙片法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。
2 結(jié)果與分析
2.1 紙片法檢測大腸埃希菌結(jié)果
將大腸埃希氏菌ATCC25922過夜培養(yǎng),將1mL菌懸液8 000 r/min離心5 min,將菌體重懸于1 mL無菌水中,按照10倍稀釋,稀釋到10-6后,將1 mL菌懸液或無菌生理鹽水滴加至紙片法上,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)16~24 h,觀察紙片上菌落的生長情況。在紙片法上呈均勻紫藍(lán)色者為陰性(圖1A),紙片上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),外周黃暈或紙片產(chǎn)生黃色背景者為陽性紙片(圖1B)。
2.2 TTC濃度對(duì)試紙片檢測結(jié)果的影響
不同濃度TTC用量下,大腸埃希氏菌ATCC25922菌懸液培養(yǎng)后計(jì)數(shù)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)TTC濃度為0.4 mg/L時(shí),菌懸液形成菌落清晰,其生長呈現(xiàn)最好狀態(tài),即紅色菌落數(shù)目最多。在TTC的量大于或小于0.4 mg/L時(shí),所生成的紅色菌落逐漸減少。
2.3 冷水凝膠對(duì)檢測結(jié)果的影響
在培養(yǎng)基中加入可以替代瓊脂的冷水凝膠,規(guī)避了瓊脂在低溫下容易凝固的不足,同時(shí),也使紙片法質(zhì)地更為緊密均勻。如圖3所示,在培養(yǎng)基中加入不同量的冷水凝膠后,菌落形成出現(xiàn)較大變化。當(dāng)每100 mL培養(yǎng)基中加入0.7 g冷水凝膠時(shí)菌落生長最好。用量超過0.7 g時(shí),菌落數(shù)相對(duì)減少。
2.4 國標(biāo)法與紙片法法檢驗(yàn)比對(duì)
采用平板計(jì)數(shù)法和測試法分別檢測市售菠菜、牛奶、大白菜、鹵牛肉、蛋糕、果汁、豬肉7種樣品,檢測結(jié)果見表1。由表1可知,國標(biāo)法與紙片法檢測結(jié)果基本一致。
2.5 檢測特異性試驗(yàn)
分別將大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單增李斯特菌CMCC(B)54002-5、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志賀菌CMCC6120513、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028過夜培養(yǎng),培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水作10倍遞增稀釋,取合適稀釋度(一般10-5~10-7為宜)分別接種于測試片,每片各1 mL,設(shè)3次重復(fù);同時(shí)接種乳糖膽鹽發(fā)酵管3支,每支1 mL,設(shè)3次重復(fù)。將上述測試片和發(fā)酵管置37 ℃培養(yǎng) 18~24 h。大腸埃希氏菌ATCC259221培養(yǎng) 24 h后產(chǎn)酸產(chǎn)氣,判定為大腸菌群陽性;采用紙片法培養(yǎng)16 h,大腸埃希氏菌ATCC2592211出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),其周圍變黃或整張紙片變黃,按標(biāo)準(zhǔn)判定為大腸菌群陽性。而其他5株 (金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌)在紙片法均不變黃,也無紅色斑點(diǎn),按標(biāo)準(zhǔn)判定為大腸菌群陰性。紙片法檢測結(jié)果與發(fā)酵法完全一致,說明紙片法特異性與經(jīng)典的發(fā)酵法相一致。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn)
紙片法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果由表2中可知,在牛奶中添加不同濃度的大腸菌群,紙片法5次檢測結(jié)果與九管發(fā)酵法一致,表明本紙片法重復(fù)性較好。
3 小結(jié)與討論
大腸群菌作為人、畜糞便污染指標(biāo)而成為食品和餐(飲)具衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),常采用傳統(tǒng)的發(fā)酵法檢驗(yàn)。但傳統(tǒng)發(fā)酵法操作繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不利于食品和餐(飲)具的日常檢測和監(jiān)督管理[4-7]??刹捎眉埰ㄈ〈l(fā)酵法,兩法的檢測結(jié)果基本一致,而紙片法具有簡便、快速、省時(shí)、省力等優(yōu)點(diǎn)。
紙片法在快速檢驗(yàn)食品中大腸菌群有較好的效果,但食品成分比水要復(fù)雜的多,細(xì)菌相的組成也比較復(fù)雜,影響因素也多,因此下階段要進(jìn)一步深入對(duì)營養(yǎng)液配方的研究,使紙片法適合大部分食品的檢測需求,或者根據(jù)不同類別的食品研制專用檢測紙片。
參考文獻(xiàn):
[1] 潘慧華,李晶晶,劉堅(jiān)真.大腸菌群一步發(fā)酵法檢測的研究[J].食品科學(xué),2007,27(12):637-641.
[2] GB 4789.3-2010,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[S].
[3] 呂肖楠.大腸菌群快速檢測方法的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.
[4] 孫京新,李曉峰,于海峰,等.肉品中菌落總數(shù)和大腸菌群快速檢測試紙片的研究[J].肉類工業(yè),2009(7):23-26.
[5] 唐漪靈.Petrifilm紙片法和國標(biāo)法檢測奶制品細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)的結(jié)果比較[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2000,10(3):326-327.
[6] 邢業(yè)蘭,張維華.食品用TTC紙片測定飲水大腸菌群初探[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn),1998,8(5):291-293.
[7] 井良義,楊艷麗,劉 軍.大腸菌群快檢紙片質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國公共衛(wèi)生,2002,18(1):98-99.