馬思遠(yuǎn)，王?；?，林雨彬，曾若菡，刁曉平*，李 鵬

（1.熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158；2.海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；3.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158；4.海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南 海口 570228）

檳榔（Areca catechuL.）屬棕櫚科多年生常綠喬木，是熱帶珍貴藥用植物，為四大南藥之首。檳榔果實(shí)具有消積驅(qū)蟲、降氣行水之功效，主要用來治療人體腸道寄生蟲、食積腹痛、水腫脹滿、痢疾、腳氣腫痛等疾病[1]。海南省是我國檳榔的主產(chǎn)區(qū)[2]，全省檳榔種植面積約102 530 hm2，占全國檳榔種植總面積的95%；產(chǎn)量約255 114噸，占全國產(chǎn)量的95%以上。目前海南檳榔產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值已超過百億元，成為海南省重要的支柱產(chǎn)業(yè)[3]。

植物根際微生物對植物的健康發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，目前植物與根際微生物的互作已成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。植物根系能通過其分泌的各種次生代謝物質(zhì)使根際微生物的種類、分布和數(shù)量發(fā)生改變，對根際微生物群落結(jié)構(gòu)有選擇塑造作用[4]，而根系分泌物介導(dǎo)下的植物－微生物互作對于土壤肥力及植物生長發(fā)育有著極其重要的作用[5]，例如一些有機(jī)肥可以在根系分泌物介導(dǎo)下通過提高根際微生物多樣性及微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性來提高獼猴桃的生產(chǎn)效率[6]?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為根際微生物群落的宏基因組是植物體的第二基因組[7]，而且植物的他感作用、連作障礙、連作促進(jìn)或間套作增產(chǎn)等均是由其根系分泌物介導(dǎo)下的植物與特異微生物共同作用的結(jié)果[4]。

已有研究結(jié)果顯示，微生物群落結(jié)構(gòu)容易受到土壤理化性質(zhì)、季節(jié)變化、海拔以及地形等外界因素影響[8-9]。即使在相同的氣候和土壤條件下，不同區(qū)域的土壤微生物也會有差別[10]。高通量測序技術(shù)具有成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn)[11]，在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12-13]。目前還未見關(guān)于檳榔根際微生物多樣性的相關(guān)報(bào)道，為揭示檳榔根際微生物分布特征，本研究擬在海南省萬寧市、陵水縣和三亞市3個(gè)重要的檳榔種植區(qū)域采集根際土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)系統(tǒng)分析3個(gè)區(qū)域檳榔根際土壤細(xì)菌群落組成及多樣性，并探討不同區(qū)域之間檳榔根際微生物的相關(guān)性，以期為研究檳榔根際微生物互作等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 采樣地點(diǎn)

在海南省萬寧市、陵水縣和三亞市3個(gè)主要檳榔種植區(qū)分別選取一個(gè)檳榔生長年份相同的地塊（30 m×30 m）作為采樣地點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)大約種植150棵檳榔樹。采樣點(diǎn)具體情況如表1所示。

表1 采樣點(diǎn)概況Table 1 Overview of the sampling site

1.2 樣品采集方法

將上述3個(gè)采樣點(diǎn)分別平均劃分為10個(gè)小區(qū)域，于2019年1月8—9日在每個(gè)小區(qū)域中選取3～4棵檳榔樹，刨出根部，用剪刀剪下10 cm左右根系組織，收集附著在根系組織上的土壤樣品。每棵樹取4～5根根系，每個(gè)小區(qū)域混合為一份樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)共10份根系組織樣品，本研究共采集30份根系組織樣品。另于每個(gè)采樣點(diǎn)未種植檳榔樹的空地上分別采集3份土壤樣品作為對照，共采集9份對照土壤樣品。在土樣采集時(shí)均佩戴新的無菌手套，采集的根系組織樣品裝于塑封袋后迅速置于冰盒中保存。對照和根系組織樣品附著的土壤用于提取根際細(xì)菌DNA、高通量測序及理化性質(zhì)測定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

采集得到的土壤經(jīng)自然晾干之后，按標(biāo)準(zhǔn)法測定樣品的基本理化性質(zhì)[14]。測量指標(biāo)包括pH、有機(jī)質(zhì)（Organic Matter，OM）、全氮（Nitrogen，N）、堿解氮（Alkali-Hydrolyzable Nitrogen，HN）、全磷（Phosphorus，P）、速效磷（Olsen-P，OP）、全鉀（Kalium，K）、速效鉀（Olsen-K，OK）。所有土壤樣品理化性質(zhì)由海南樂東香蕉枯萎病及熱帶作物土傳病防控所進(jìn)行測定。

1.4 根際土壤細(xì)菌DNA提取及測序

將采集的根際土壤樣品分別放置于裝有30 mL PBS緩沖液的50 mL離心管中，超聲處理15 min，棄根系組織后再于8 000 rpm、4 ℃條件下離心20 min，棄上清，收集土壤樣品直接進(jìn)行DNA提取或置于-80 ℃冰箱備用。采用德國QIAGEN 公司的DNeasy PowerSoil Kit 試劑盒提取土壤樣品DNA，利用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 1000）檢測其DNA濃度，質(zhì)量合格后進(jìn)行擴(kuò)增子測序分析。

以338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)為擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的引物，利用Illumina Miseq 2300測序平臺對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序。

1.5 細(xì)菌多樣性分析

測序完成后，經(jīng)過過濾處理得到優(yōu)化序列?；?7%的相似性閾值進(jìn)行細(xì)菌操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）聚類。基于分類學(xué)信息在屬水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。利用美吉云平臺（https://cloud.majorbio.com）完成分析對比工作。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照土壤樣品理化性質(zhì)

3個(gè)不同采樣點(diǎn)的對照土壤樣品理化性質(zhì)檢測結(jié)果見表2，3個(gè)采樣點(diǎn)對照土樣的pH、有機(jī)質(zhì)、全鉀、速效磷和速效鉀等理化因子差異明顯。其中，萬寧采樣點(diǎn)的pH最低，三亞采樣點(diǎn)的pH最高；三亞采樣點(diǎn)的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于萬寧和陵水采樣點(diǎn)；陵水采樣點(diǎn)的全鉀和速效鉀含量顯著高于萬寧和三亞采樣點(diǎn)；三亞采樣點(diǎn)速效磷含量最高，且顯著高于萬寧和陵水采樣點(diǎn)。

表2 3個(gè)采樣點(diǎn)對照土樣的主要理化性質(zhì)Table 2 Main physical and chemical properties of soil samples from three sampling sites

通過走訪當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶得知，采樣前陵水采樣點(diǎn)的農(nóng)戶施加過鉀元素含量較高的肥料，三亞采樣點(diǎn)的農(nóng)戶施加過草甘膦除草劑，可能為導(dǎo)致陵水采樣點(diǎn)對照土樣的鉀元素含量和三亞采樣點(diǎn)對照土樣的速效磷含量均較高的主要原因。

2.2 檳榔根際土壤細(xì)菌群落多樣性

通過Illumina Miseq高通量測序后，按97%相似度聚類，得到4 989個(gè)OTUs，各樣品文庫覆蓋率均在99%以上，能夠反映3個(gè)典型種植區(qū)檳榔根際土壤微生物群落的真實(shí)情況（表3）。陵水采樣點(diǎn)根際土壤細(xì)菌的Chao1 指數(shù)為471，顯著高于萬寧（354）和三亞（388）（P<0.05）。萬寧和三亞采樣點(diǎn)根際土壤細(xì)菌的Shan?non 指數(shù)分別為2.41和2.07，顯著低于陵水（3.11）（P<0.05）。陵水采樣點(diǎn)的檳榔根際土壤細(xì)菌豐富度以及多樣性都顯著高于萬寧和三亞，而萬寧和三亞差別不大。結(jié)合陵水采樣點(diǎn)對照土壤鉀元素含量與其它兩個(gè)采樣點(diǎn)有顯著差異，研究結(jié)果與姚一文等得出的鉀元素含量對物種多樣性影響較大相符[15]。

表3 3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌OTU及多樣性指數(shù)Table 3 OTU and diversity index of Areca catechu rhizosphere bacteria in three sampling sites

2.3 檳榔根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

為解析海南省3個(gè)區(qū)域檳榔根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征，本研究對聚類后的OTU代表序列進(jìn)行了物種注釋。3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌OTU 隸屬于33門88綱222目387科770屬。將所有相對豐度低于1%以及在該水平上沒有注釋結(jié)果的OTU歸于其他類群。在屬水平上，3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤中相對豐度較高的細(xì)菌為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）和腸桿菌屬（Enterobacter），其相對豐度分別為10.94%～46.96%和12.16%～28.14%，但不同采樣點(diǎn)的優(yōu)勢菌及其相對豐度存在較大差異（圖1）。萬寧采樣點(diǎn)檳榔根際土壤中伯克霍爾德菌屬的相對豐度最高（46.96%），其次為腸桿菌屬（12.16%）和科薩克氏菌屬（Kosakonia）（2.28%）；陵水采樣點(diǎn)的檳榔根際土壤中科薩克氏菌屬的相對豐度最高（15.97%），其次為伯克霍爾德菌屬（15.28%）和腸桿菌屬（12.48%）；三亞采樣點(diǎn)檳榔根際土壤中假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度最高（31.47%），其次為腸桿菌屬（28.14%）和伯克霍爾德菌屬（10.94%）。此外，芽孢桿菌屬（Bacillus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度也都超過了1%。

在屬水平上分析3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)3個(gè)采樣點(diǎn)的檳榔根際土壤樣品中共同含有的屬有431個(gè)，陵水采樣點(diǎn)獨(dú)有71個(gè)屬，萬寧和三亞采樣點(diǎn)分別獨(dú)有46和45個(gè)屬（圖2A）。在共有的屬中，伯克霍爾德菌屬的相對豐度最高，占總核心菌屬的23.40%，其次是腸桿菌屬（17.70%）、假單胞菌屬（11.90%）、科薩克氏菌屬（8.94%）、芽孢桿菌屬（3.78%）、Enterobacteriacead(1.76%)、不動桿菌屬(1.60%)和Subgroup-2(1.24%)等（圖2B）。伯克霍爾德菌屬、腸桿菌屬、科薩克氏菌屬以及假單胞菌屬同屬于變形菌門（Proteobacteria），上述結(jié)果說明變形菌門的細(xì)菌在檳榔根際土壤生態(tài)環(huán)境構(gòu)建和物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，已有研究人員發(fā)現(xiàn)變形菌門的細(xì)菌是多種土壤環(huán)境的優(yōu)勢菌[16-17]，說明其生態(tài)幅較寬，對土壤環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。本研究中，除了變形菌門的細(xì)菌外，酸桿菌門（Acidobacteria）的Acidobacteriales和Subgroup-2相對豐度也較高，可能與3個(gè)采樣點(diǎn)土壤酸性均較強(qiáng)有關(guān)[18]。

圖1 三個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌群落相對分布特征Figure 1 Relative redundancies characteristics of Areca catechu bacterial community structure in three sam?pling sites at genus level

圖2 檳榔根際土壤細(xì)菌核心類群Figure 2 Bacterial core groups of areca rhizosphere soil

分別對3個(gè)采樣點(diǎn)兩兩共有的相對豐度較高的檳榔根際土壤細(xì)菌進(jìn)行組間差異分析后發(fā)現(xiàn)，萬寧和陵水采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌中伯克霍爾德菌屬和芽孢桿菌屬的相對豐度有極顯著差異（P<0.01），而假單胞菌屬、熱酸菌屬（Acidothermus）和Xanthoacteraceae的相對豐度有顯著性差異（P<0.05）（圖3）；萬寧和三亞采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌中伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、熱酸菌屬和不動桿菌屬的相對豐度有極顯著差異（P<0.01），腸桿菌屬的相對豐度有顯著性差異（P<0.05）（圖4）；陵水和三亞采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌中假單胞菌屬的相對豐度有極顯著差異（P<0.01），腸桿菌屬和克雷白氏桿菌屬（Kisbsiella）的相對豐度有顯著性差異（P< 0.05）（圖5）。其中，假單胞菌屬的相對豐度在3 組分析中均有顯著性差異（P<0.05），三亞采樣點(diǎn)的相對豐度最高（31.47%），萬寧采樣點(diǎn)最低（0.36%）。已有研究表明假單胞菌屬的某些菌株可以幫助修復(fù)環(huán)境，例如使用變形假單胞菌2，4-D 處理的大麥種子在土壤中發(fā)芽和生根的概率會提高[19]。筆者在田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，三亞采樣點(diǎn)檳榔根系生長整齊且粗壯，明顯好于萬寧和陵水采樣點(diǎn)的檳榔根系，可能與其假單胞菌屬的相對豐度較高有關(guān)。

圖3 萬寧（WN）和陵水（LS）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌相對豐度差異分析Figure 3 Difference analysis of relative abundance of soil bacteria in Areca catechu rhizosphere between WN and LS

圖4 萬寧（WN）和三亞（SY）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌相對豐度差異分析Figure 4 Difference analysis of relative abundance of soil bacteria in Areca catechu rhizosphere between WN and SY

圖5 陵水（LS）和三亞（SY）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌相對豐度差異分析Figure 5 Difference analysis of relative abundance of soil bacteria in Areca catechu rhizosphere between LS and SY

2.4 檳榔根際土壤細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的探索是確定微生物群落中發(fā)生生物相互作用的一種有效途徑[20]。本研究選用Pearson模型，以相對系數(shù)絕對值≥0.5、Pvalue<0.05對不同采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌中相對豐度排在前50位的屬進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萬寧和陵水采樣點(diǎn)的單因素網(wǎng)絡(luò)是連通的，網(wǎng)絡(luò)直徑分別為8和6，節(jié)點(diǎn)間平均最短路徑長度分別為2.795 和2.236。在萬寧采樣點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中心性數(shù)值最高的節(jié)點(diǎn)為變形菌門（Proteobacte?ria）的Micropepsaceae屬，可以和26個(gè)屬進(jìn)行互作，且全部為正相關(guān)（圖6）。在陵水采樣點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中心性數(shù)值最高的節(jié)點(diǎn)是綠彎菌門（Chloroflexi）的Subgroup-6屬，與其它27個(gè)屬互作頻繁，且多數(shù)為正相關(guān)，但是與變形菌門的2個(gè)屬呈負(fù)相關(guān)（圖7）。在三亞采樣點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中心性數(shù)值最高的節(jié)點(diǎn)是酸桿菌門（Acidobacteria）的獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter），與其它23個(gè)屬相關(guān)性較強(qiáng)，且全部為正相關(guān)（圖8）。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，控制微生物群落的潛在因素因空間規(guī)模而異[21]。本研究中，3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌互作模式存在明顯的差異，可能與不同采樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)和植物群落功能屬性不同有關(guān)。已有報(bào)道表明，獨(dú)活假絲酵母屬是分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的菌屬，其相對豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量正相關(guān)[22]。本研究中，三亞采樣點(diǎn)的獨(dú)活假絲酵母屬與其他屬的相關(guān)性較強(qiáng)，可能與三亞采樣點(diǎn)土壤的有機(jī)質(zhì)含量較高有關(guān)。

圖6 萬寧（WN）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)Figure 6 Bacterial interaction network in Areca catechu rhizosphere soil in Wanning sampling sites

圖7 陵水（LS）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)Figure 7 Bacterial interaction network in Areca catechu rhizosphere soil in Lingshui sampling sites

圖8 三亞（SY）采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌互作網(wǎng)絡(luò)Figure 8 Bacterial interaction network in Areca catechu rhizosphere soil in Shanya sampling sites

3 結(jié)論

萬寧、陵水和三亞3個(gè)區(qū)域檳榔根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。共獲得4 989個(gè)OTUs，隸屬于33門770屬，伯克霍爾德菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌屬相對豐度較高。假單胞菌屬在三個(gè)區(qū)域間存在顯著性差異，其中三亞采樣點(diǎn)的相對豐度最高（31.47%），萬寧采樣點(diǎn)最低（0.36%）。對3個(gè)地區(qū)檳榔根際土壤細(xì)菌群落中相對豐度排在前50位的屬進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，3個(gè)采樣點(diǎn)檳榔根際土壤細(xì)菌互作模式存在明顯的差異，Micropepsaceae、Subgroup-6和獨(dú)活假絲酵母屬在互作網(wǎng)絡(luò)中與其他微生物類群密切互作。