李 旋 馮艷微 袁 波 姜 緒 何金霞 劉相全

皺紋盤鮑()基因生物信息學分析及與性腺發(fā)育相關(guān)性的研究*

李 旋1, 2, 3馮艷微4①袁 波1, 2, 3姜 緒3何金霞3劉相全3

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306; 2. 上海海洋大學 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 上海 201306; 3. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006; 4. 魯東大學農(nóng)學院 煙臺 264025)

作為基因家族的重要成員, 在動物的性腺發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。從皺紋盤鮑()轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得基因的cDNA序列, 該序列長2002 bp, 包括5′非編碼區(qū)(5′UTR) 342 bp, 3′非編碼區(qū)(3′UTR) 595 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為1 071 bp, 可以編碼356個氨基酸。該蛋白序列與福壽螺()、長牡蠣()、櫛孔扇貝()和厚殼貽貝()的同源性分別為71.86%、70.92%、67.51%和65.32%。通過qRT-PCR分析基因在雌雄皺紋盤鮑不同月份不同組織中的表達特點, 其結(jié)果顯示, 除肝胰腺外,基因在其雌雄個體不同月份的鰓、外套膜、肌肉和性腺中均有表達; 在雌性個體性腺中,基因的表達量以7月份為最高, 顯著高于其他月份; 其次為5、8月, 顯著高于6、9月的表達量; 5月與8月、6月與9月之間均差異不顯著。在雄性個體性腺中, 不同月份的表達量7月>8月>9月>5月>6月; 7、8月的表達量均顯著高于其他月份, 9月顯著高于6月的表達量, 與5月差異不顯著, 5月表達量與6月差異不顯著。此外,基因在精巢的表達量均高于卵巢。原位雜交(ISH)結(jié)果顯示,在5—9月雌性皺紋盤鮑性腺的卵母細胞和雄性性腺的結(jié)締組織均有明顯的藍紫色雜交信號。皺紋盤鮑基因在各個組織均有表達, 表明其的表達特點是廣泛性的, 參與多種組織細胞的生命過程; 在不同月份性腺中的表達特征, 推測其可能在兩性性腺發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

皺紋盤鮑;基因; 性腺發(fā)育; 表達分析; 原位雜交

皺紋盤鮑()隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda) (王如才等, 2008), 在我國主要分布于山東、遼寧、福建、臺灣、廣東等沿海區(qū)域(黎中寶等, 2005), 具有個頭大、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、味道鮮美等特點, 被譽為海產(chǎn)品中的“海珍之冠”, 備受養(yǎng)殖戶喜愛。近年來, 我國鮑養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大, 產(chǎn)量逐年遞增, 但在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)種鮑性腺發(fā)育不均衡, 對后續(xù)的苗種繁育與養(yǎng)殖產(chǎn)生不利影響。目前, 性別決定與分化調(diào)控基因及性腺發(fā)育調(diào)控機制在許多動物中相繼被發(fā)現(xiàn), 但對皺紋盤鮑性腺發(fā)育相關(guān)的分子機制研究較少。

(Wingless-type MMTV integration site family)是一類可以編碼分泌性糖蛋白的基因家族(Smolich, 1993), 具有高度保守性, 能夠激活多種信號通路, 參與動物體內(nèi)多種生物學過程的調(diào)控, 同時對早期器官形成和發(fā)育具有一定的影響(Logan, 2004; 韓琳等, 2008; 楊梅等, 2015)。家族重要成員之一的(wingless-type MMTV intergration site family, member 4)基因, 已經(jīng)在小鼠()、櫛孔扇貝()、烏賊()、果蠅()、人()等多個物種中進行了不同程度的功能研究(Nusse, 1982; van Ooyen, 1984; 李海龍等, 2013)。研究發(fā)現(xiàn),在性別決定與性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在小鼠中,基因影響卵巢發(fā)育, 參與繆勒氏管的形成(Stark, 1994); 在人類中,基因與基因協(xié)同調(diào)控女性卵巢發(fā)育并阻止睪丸的形成, 表明其參與性別決定(Jordan, 2001); 在黑鯛中,基因參與了卵巢的早期發(fā)育、生長和成熟過程的調(diào)控(Wu, 2009); 在櫛孔扇貝中,基因在不同組織(外套膜、鰓、閉殼肌、肝胰腺、精巢和卵巢)中均有表達, 且在成熟期的精卵巢中表達量最高, 表明其在兩性性腺成熟過程中起到重要作用(李海龍等, 2013); 在長牡蠣中,基因表達量最高的階段為胚胎發(fā)育早期, 說明其在早期發(fā)育階段與某些器官的形成有關(guān)(楊梅等, 2015)。

作為一種重要的信號分子, 在脊椎動物中已有深入研究, 但在軟體動物中研究還非常有限。本研究以皺紋盤鮑為研究對象, 從前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得基因序列, 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測其在雌雄個體不同月份不同組織中的表達規(guī)律, 并通過原位雜交技術(shù), 定位分析其在不同月份雌雄性腺中的分布情況, 初步探究基因在性腺發(fā)育中的作用, 為進一步研究基因的表達特點和功能及軟體動物腹足類基因家族提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用皺紋盤鮑均采自山東省威海市尋山養(yǎng)殖基地。5—9月每月底(恢復期、生長期成熟前期、成熟期、放卵末期放精末期; 劉永峰等, 1985)各取雌雄個體各五只作為實驗個體, 解剖取其鰓、肌肉、性腺、肝胰腺和外套膜組織置于液氮中, 后轉(zhuǎn)移到–80 °C冰箱保存, 依次進行總RNA的提取。

1.2 WNT4基因序列的獲得與驗證

從皺紋盤鮑前期構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得基因序列, 設(shè)計驗證引物(表1)。采用Trizol試劑提取成熟性腺組織總RNA, 通過核酸定量儀和1.0%的瓊脂糖凝膠檢測其質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Dalian, China), 反應(yīng)體系(10 μL): 1 μL Oligo dT Primer, 1 μL Random 6 mers, 1 μL dNTP Mixture, 1 μg模板RNA, 6 μL RNase Free dH2O, 反應(yīng)程序: 65 °C 5 min; 冰上迅速冷卻2 min。反應(yīng)體系(20 μL): 10 μL上述變性后反應(yīng)液, 4 μL 5×PrimerScriptⅡ Buffer, 0.5 μL RNase Inhibitor, 1 μL PrimerScriptⅡ RTase, 4.5 μL RNase Free dH2O, 反應(yīng)程序: 30 °C 10 min; 42 °C 60 min; 70 °C 15 min。擴增試劑盒采用Tks GflexTMDNA Polymerase (TaKaRa, Dalian, China), 反應(yīng)體系(50 μL): 1 μL cDNA, 25 μL 2×Glef PCR Buffer (Mg2+, dNTP plus), 1 μL Tks Glef DNA Polymerase, 1 μL W-F, 1 μL W-R, 21 μL RNase Free dH2O, 反應(yīng)程序: 94 °C 1 min; 98 °C 10 s, 55 °C 15 s, 68 °C 90 s, 35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測, 送上海生物工程有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

預測基因的開放閱讀框使用ORF Finder 軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/orfig. cgi); 同源分析利用NCBI Blastx軟件(https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg)進行; 預測氨基酸結(jié)構(gòu)使用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/); 預測其分子量和等電點使用ExPASy軟件(http://web. expasy.org/compute_pi/); 預測信號肽序列利用SingalP 5.0 Server軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/); 多序列比對使用DNAMAN軟件進行; 鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹使用MAGE 5.0軟件; 利用Phyre2軟件預測二級結(jié)構(gòu); 利用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/)預測三級結(jié)構(gòu)。

1.4 不同月份各組織表達分析

通過Trizol試劑提取不同月份各組織中的總RNA, 并利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop Onec分光光度計(Thermo, USA)檢測其質(zhì)量和濃度。熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China), 反應(yīng)體系為20 μL, 添加試劑如下: 2 μL的5×gDNA Eraser Buffer, 1 μL的gDNA Eraser, 適量(500 ng)的total RNA, 加入RNase Free dH2O補足至10 μL, 42 °C反應(yīng)2 min; 在上述反應(yīng)液中依次加入PrimeScript RT Enzyme Mix I試劑1 μL, RT Primer Mix試劑1 μL, 5×PrimeScript Buffer 2試劑4 μL, RNase Free dH2O試劑4 μL, 37 °C反應(yīng)15 min, 85 °C反應(yīng)5 s, 反應(yīng)樣品4 °C保存。

根據(jù)已獲得的基因的開放閱讀框序列, 設(shè)計qRT-PCR引物, 皺紋盤鮑基因作為內(nèi)參(表1)。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TaKaRa, Dalian, China)試劑和LightCycler?480ⅡReal Time instrument (Roche Switzerland)測定其在不同月份不同組織(鰓、肝胰腺、肌肉、外套膜、卵巢和精巢)的相對表達水平, 每個樣品設(shè)置3個重復。反應(yīng)體系為20 μL: 加入10 μL的2×TB Green Premix Ex Taq試劑, 7.2 μL的RNase Free水, 0.4 μL的上游引物和0.4 μL的下游引物, 2 μL的cDNA模板。反應(yīng)程序為95 °C 30 s; 95 °C 5 s, 60 °C 30 s, 40個循環(huán), 95 °C 5 s; 60 °C 1 min; 95 °C, 50 °C 30 s。使用2–ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 本實驗皺紋盤鮑基因使用的引物

Tab.1 The information of H. discus hannai WNT4 primers

1.5 原位雜交

用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性ISH引物, RT-PCR擴增產(chǎn)物純化后連接到PGEM-T easy載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài), 菌落PCR篩選陽性克隆, 之后以通用引物T7 (TAATACGACTCACTATAGGG)送上海生物工程有限公司測序; 利用DIG RNA Labeling Mix (Roche, Germany)試劑盒得到基因標記探針, 并將合成的探針保存在–80 °C冰箱。將不同月份雌雄皺紋盤鮑性腺組織通過4%多聚甲醛固定, 并在4 °C的條件下放置24 h后保存在70%酒精中。把組織進行梯度脫水、包埋制片處理, 后用石蠟切片機(Leica, Germany)切片, 厚度在3—8 μm之間。然后使用 DIG nucleic acid detection kit (SP6/T7; Roche, Germany)試劑盒進行原位雜交實驗, 并使用顯色劑避光顯色, 使用顯微鏡(Tokyo, Japan)觀察雜交信號并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0軟件分析基因在皺紋盤鮑不同月份不同組織的表達數(shù)據(jù),<0.05具有統(tǒng)計學意義, 根據(jù)基因表達數(shù)據(jù)使用Origin 8.5軟件繪制條形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 WNT4基因序列特征

從皺紋盤鮑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得基因序列, 該序列長2002 bp, 包括5′非編碼區(qū)(5′UTR) 342 bp, 3′非編碼區(qū)(3′UTR) 595 bp, 開放閱讀框(ORF)長度為1071 bp, 能夠編碼356個氨基酸。預測其蛋白分子質(zhì)量為39.85 kDa, 理論等電點為9.21。其氨基酸序列中含有23個WNT家族蛋白最重要的半胱氨酸保守序列(圖1)以及172個WNT家族蛋白保守位點(圖2), 同時還具有一段長為27個氨基酸的信號肽序列和310個氨基酸的WNT1結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 WNT4基因的同源性與系統(tǒng)進化分析

NCBI blastx分析結(jié)果顯示, 皺紋盤鮑與福壽螺()、長牡蠣()、櫛孔扇貝()和厚殼貽貝()的同源性分別為71.86%、70.92%、67.51%和65.32% (圖2)。

根據(jù)皺紋盤鮑氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹得出, 其基因首先與福壽螺()聚為一支, 之后與櫛孔扇貝()、長牡蠣()和厚殼貽貝()聚為一類, 表明該基因的系統(tǒng)進化關(guān)系與傳統(tǒng)的物種進化地位基本一致(圖3)。根據(jù)SWISS-MODEL建模結(jié)果可得, 同源模版與WNT4蛋白序列的相似性為52.29%, QMEAN為–1.98, GMQE為0.73 (圖4), 結(jié)果說明該蛋白與模版蛋白的匹配度較高, 其中α螺旋占比為43%, 無規(guī)則卷曲占比為30%, β折疊占比為13%, TM螺旋占比為4% (圖5)。

圖1 皺紋盤鮑WNT4基因的cDNA序列及其推導出的氨基酸序列

注: 圖中下劃線標出的是起始密碼子ATG和終止密碼子TGA, 陰影部分為保守區(qū)域氨基酸序列, 保守的半胱氨酸殘基(C)用雙下劃線標出, 信號肽用波浪用下劃線標出

圖2 不同物種WNT4氨基酸序列多重比對分析

注: 陰影區(qū)域顯示的是同源性氨基酸, 其中氨基酸的同源性是100%為黑色區(qū)域, 氨基酸的同源性是75%以上的為灰色區(qū)域。各物種縮寫如下: 櫛孔扇貝(, Af), 長牡蠣(, Cg), 皺紋盤鮑(, Hd), 人(, Hs), 厚殼貽貝(, Mc), 高山倭蛙(, Np), 樹袋熊(, Pc), 福壽螺(, Po)

圖3 基于WNT4氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

注: 節(jié)點上的數(shù)字表示重復1000次的自舉(Bootstrap)檢驗置信值

圖4 WNT4三級結(jié)構(gòu)預測

2.3 WNT4基因在不同月份不同組織中的定量表達分析

利用實時熒光定量方法分析基因在皺紋盤鮑雌雄個體不同月份不同組織中的相對表達量(圖6, 7)。實驗結(jié)果顯示, 除肝胰腺外,基因在雌雄個體不同月份的外套膜、肌肉、性腺和鰓中均有表達; 在雌性個體不同月份中, 肌肉的表達量均最高; 在雄性個體中, 5、6、8、9月肌肉表達量最高, 7月性腺表達量最高; 不同月份雌雄個體鰓中的表達量均為最低。

在雌雄個體中, 肌肉在8月份表達量均最高, 顯著高于其他月份; 7月份表達量均最低。外套膜在雌性個體中7月表達量最高, 顯著高于其他月份, 在雄性個體中9月表達量最高, 顯著高于7、8月, 與5、6月差異不顯著。在雌性個體性腺中,基因的表達量以7月份為最高, 顯著高于其他月份; 其次為5、8月, 顯著高于6、9月的表達量; 5月與8月、6月與9月之間均差異不顯著。在雄性個體性腺中, 不同月份的表達量7月>8月>9月>5月>6月; 7、8月的表達量均顯著高于其他月份, 9月顯著高于6月的表達量, 與5月差異不顯著, 5月表達量與6月差異不顯著。此外,基因在精巢的表達量均高于卵巢。

圖5 WNT4二級結(jié)構(gòu)預測

圖6 雌性皺紋盤鮑中WNT4基因在不同月份不同組織中的表達

注: 不同字母(a, b, c, d)表示不同月份相同組織表達存在顯著性差異(<0.05), 相同字母表示組間無顯著性差異。下同

圖7 雄性皺紋盤鮑中WNT4基因在不同月份不同組織中的表達

2.4 原位雜交結(jié)果分析

對基因在雌雄皺紋盤鮑不同月份性腺進行定位分析。原位雜交結(jié)果(圖8)顯示在實驗組中, 雌性不同月份性腺中均存在明顯的藍紫色雜交信號, 主要位于卵母細胞的細胞質(zhì)和細胞核中; 在雄性不同月份性腺中也存在藍紫色雜交信號, 主要位于結(jié)締組織上。雌雄性腺均為7月份雜交信號最強。對照組中均無信號。

注: 實驗組(a—e為5—9月份雌性性腺, f—j為5—9月份雄性性腺), 陰性對照(1—5為雌性, 6—10為雄性); Oo. 卵母細胞, Fw. 濾泡壁, Sc. 精原細胞, Ct. 結(jié)締組織, 標尺為50 μm

3 討論

信號通路作為一條極其保守的信號傳導途徑, 在生物體內(nèi)具有廣泛調(diào)控多種生物學過程的作用(Niehrs, 2012)。基因是家族成員的重要一員。Nusse等(1992)研究發(fā)現(xiàn),家族成員是由350—380個氨基酸構(gòu)成的分泌型糖蛋白, 具有23或24個保守的半胱氨酸殘基, 并分布著100多個保守位點。本研究發(fā)現(xiàn), 皺紋盤鮑的基因可以編碼356個氨基酸, 氨基酸序列含有23個WNT家族蛋白最重要的半胱氨酸保守序列以及172個WNT家族蛋白保守位點, 同時還含有一段長為27個氨基酸的信號肽序列, 這與Nusse等(1992)的研究結(jié)果一致, 表明基因具有高度保守性。

基因作為一種信號分子普遍存在于生物體中, 并參與多種生命過程。劉斐斐等(2020)通過熒光定量qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),基因在雌雄三角帆蚌的斧足、外套膜、肝臟、閉殼肌、鰓、精巢和卵巢中均有表達; 虹鱒()、斑馬魚、青鳉等魚類中存在和兩種基因(Liu, 2000; Inohaya, 2010; Nicol, 2012)。在虹鱒中,基因與人、小鼠等哺乳動物的序列同源性在80%以上, 并在其卵黃發(fā)生晚期的卵巢、Ⅱ期精巢、皮膚、鰓、肌肉和肝等多種組織中均有表達; 其基因與人、小鼠等哺乳動物的序列同源性小于60%, 在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(Nicol, 2012); 此外,基因在櫛江珧、厚殼貽貝的外套膜、閉殼肌、性腺和鰓中也均有表達(王昌勃等, 2016; 徐躍峰等, 2016)。與以上研究結(jié)果類似, 本研究中基因在皺紋盤鮑雌雄個體肌肉、性腺、外套膜和鰓中均有表達, 具有廣泛的組織表達特點, 推測基因參與了皺紋盤鮑多種組織細胞的生命過程。

基因在動物性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在小鼠中,基因通過調(diào)節(jié)下游基因()表達, 參與小鼠卵巢發(fā)育調(diào)控(Yao, 2004)。Prunskaite-Hyyrylainen等(2014)研究發(fā)現(xiàn),基因缺失導致卵巢卵泡發(fā)育受阻, 雌性小鼠生育能力嚴重下降, 最終導致卵巢早衰,基因影響小鼠卵巢卵泡細胞的發(fā)育。在牙鲆中, 翁申達(2013)發(fā)現(xiàn)基因在卵巢和精巢中均有表達, 有卵巢強于精巢1.5倍的性別二態(tài)性, 與性腺分化發(fā)育相關(guān)。在櫛孔扇貝中, 李海龍等(2013)發(fā)現(xiàn)基因在性腺的不同發(fā)育時期中均有表達, 在性腺的成熟期中的表達量為最高, 且精巢表達量顯著高于卵巢。在本研究中, 熒光定量PCR表明皺紋盤鮑基因在雌雄個體不同月份性腺組織中均有表達, 其中7月份表達量最高; 原位雜交結(jié)果也顯示在雌雄皺紋盤鮑不同月份性腺中均呈現(xiàn)出明顯的藍紫色雜交信號, 7月份信號最強。據(jù)劉永峰等(1985)研究發(fā)現(xiàn), 皺紋盤鮑的精巢與卵巢在7月底均處于成熟期, 說明基因參與了皺紋盤鮑兩性性腺的發(fā)育和生殖細胞的成熟過程?；蛟诎櫦y盤鮑精巢的表達量高于同時期卵巢的表達量, 與對櫛孔扇貝、虹鱒的研究結(jié)果一致(Nicol, 2012; 李海龍等, 2013)。

4 結(jié)論

本研究獲得了皺紋盤鮑基因的cDNA序列。qRT-PCR結(jié)果顯示,基因在不同月份的不同組織中均有表達, 表明其組織表達具有廣泛性, 推測其參與了各種組織細胞的生命過程; ISH結(jié)果顯示, 在皺紋盤鮑雌雄性腺中基因在不同月份均有明顯的雜交信號, 與熒光定量結(jié)果一致, 推測其可能在兩性性腺發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

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LI Xuan1, 2, 3, FENG Yan-Wei4, YUAN Bo1, 2, 3, JIANG Xu3, HE Jin-Xia3, LIU Xiang-Quan3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 4. Ludong University, College of Agriculture, Yantai 264025, China)

As an important member of thegene family,plays a pivotal role in development processes of many animals.In the present study, the cDNA sequence ofgene was obtained from the transcriptome library of. The length of thegene was 2 002 bp, including 5′-UTR 342 bp and 3′-UTR 595 bp. The open reading frame (ORF) was 1 071 bp, encoding a polypeptide of 356 amino acids. As revealed in the real-time quantitative PCR analysis in different tissues of male and female abalone in different months,gene was expressed in gonad, muscle, mantle and gill, but hepatopancreas. The expression level ofgene in gonad of female was the highest in July (0.05), followed by May and August, and it was significantly higher than that in June and September. There were no significant differences between May and August, and June and September. In gonads of male individuals, the expression ofin different months was in a descending order of July > August > September > May > June. The expression level in July and August were significantly higher than that in other months, and that in September was significantly higher than that in June, but not significantly different from that in May. In addition, the expression level ofgene in testis was higher than that in ovaries.hybridization results showed thathad obvious blue-purple hybridization signals in male and female gonads in different months. The expression characteristics ofin many tissues ofindicate that it has a wide range of tissue expression characteristics and participates in the life process of many tissue cells in the form of signal molecules. From the gonad expression characteristics, it is speculated that it may play a role in the development of gonadal development.

;gene; gonadal development; expression analysis;hybridization

Q78

10.11693/hyhz20201200349

* 山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目, 2017LZGC009號。李 旋, 碩士研究生, E-mail: 1453493197@qq.com

馮艷微, 博士, 講師, E-mail: fywzxm1228@163.com

2020-12-31,

2021-02-07