衛(wèi)逸君, 張安琪， 邵一帆， 李海北， 陳天姣， 師丹陽， 楊 棟， 李君文， 金 敏

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050)

抑郁癥是一種嚴(yán)重影響患者身心健康的精神紊亂疾病，在臨床上可見情緒低落、思維遲緩、行為遲鈍、意志消沉、悲痛欲絕，嚴(yán)重者會產(chǎn)生自殺傾向或伴隨妄想等精神病性癥狀〔1〕。抑郁癥已成為全球性健康難題，其發(fā)病率逐年增加，全世界總患病人數(shù)約達(dá)四億〔2〕。此外，因?yàn)閭魅静〉确蔷耦惣膊〉陌l(fā)展過程中常常伴隨精神類疾病，所以抑郁癥等精神類疾病也能夠增加非精神類疾病的發(fā)病率〔3〕。 腸道菌群是腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛參與各種生理活動，正常菌群有助于機(jī)體維持神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等功能〔4-5〕。大量研究表明大腦和腸道之間存在著雙向通訊系統(tǒng)，腸道微生態(tài)通過“微生物-腦-腸軸”作用于中樞系統(tǒng)〔6〕。因此，腸道菌群的改變與多種生理和精神疾病密切相關(guān)。抑郁等不良情緒能夠通過應(yīng)激反應(yīng)改變腸道通透性、破壞腸粘膜屏障并激活其免疫機(jī)制，從而導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂〔7〕。相應(yīng)地，通過補(bǔ)充腸道益生菌等方法調(diào)節(jié)腸道菌群可以有效改善抑郁癥狀〔8〕。本研究以大鼠為研究對象，通過構(gòu)建受不可預(yù)知性慢性應(yīng)激的抑郁大鼠模型，觀察抑郁前后腸道菌群的變化，為揭示抑郁癥的發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性Wistar大鼠16只，體重(150±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供〔批號：SCXK(京)2016-0006〕。大鼠飼養(yǎng)場所為SPF級動物房，實(shí)驗(yàn)過程保證室溫23-25 ℃，相對濕度40-60%，晝夜明暗交替12 h，大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要儀器電子天平(上海津平科學(xué)儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海滬西分析儀器廠)；高純水裝置(Millipore，衛(wèi)生裝備研究所)；Qubit2.0熒光儀(美國Thermo公司)。

1.3 主要試劑蔗糖、生理鹽水溶液、75%乙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 方法

2.1 抑郁大鼠的獲得實(shí)驗(yàn)初期，按照糖水基線測試結(jié)果將16只大鼠隨機(jī)分為對照組和應(yīng)激組，每組各8只，每兩只一籠進(jìn)行飼養(yǎng)。應(yīng)激組接受不可預(yù)知性慢性應(yīng)激(unpredictable chronic stress, CUS)，對照組不接受任何應(yīng)激，同時確保對照組飼養(yǎng)于和應(yīng)激組相同的環(huán)境但不受到應(yīng)激過程產(chǎn)生的聲音和氣味影響。應(yīng)激因素包括短時項(xiàng)目(包括束縛、空瓶刺激、夾尾、熱水游泳以及冷水游泳)和長時項(xiàng)目(禁水、禁食、傾斜45度、潮濕100 ml、無墊料、徹夜照明以及頻閃)。每天隨機(jī)給予應(yīng)激組大鼠短時項(xiàng)目和長時項(xiàng)目各一種，持續(xù)28天。實(shí)驗(yàn)第4周時，應(yīng)激組大鼠的糖水偏好率出現(xiàn)明顯下降(從70%下降到43%)，確定獲得抑郁大鼠。

2.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)快感缺失是抑郁的重要癥狀，而糖水偏好率降低能有效反映嚙齒動物出現(xiàn)快感缺失。待大鼠禁水禁食14小時后，進(jìn)行糖水偏好測試，單籠飼養(yǎng)，每個籠子分別放置1%的蔗糖水和普通水各一瓶一小時，期間30分鐘交換兩水瓶的位置以避免位置依賴性產(chǎn)生的干擾。1h后通過稱量兩水瓶重量變化計算糖水偏好率。 糖水偏好率(%)=糖水飲用量/(糖水飲用量+普通水飲用量)。

2.3 大鼠腸道微生物分析獲得抑郁大鼠模型后，將大鼠單籠放置于滅菌空籠，待其產(chǎn)出糞便，迅速裝入滅菌凍存管于液氮中速凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。隨后，將大鼠糞便樣本送至Illumina NovaSeq PE250平臺進(jìn)行16s rDNA測序。

3 結(jié)果

3.1 菌群結(jié)構(gòu)分析應(yīng)激組和對照組大鼠的大腸菌群構(gòu)成存在差異，兩組共有955個OTU，相對于對照組(170個OUT)，應(yīng)激組(71個OUT)的獨(dú)有成分較少。主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)采用線性模型，樣品間的距離越近表示它們的腸道菌群構(gòu)成相似度越高。二維分析圖(圖1A)顯示，應(yīng)激組腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)相似，聚集在中間區(qū)域，而對照組聚集在右下角區(qū)域，兩者有明顯區(qū)分。 Anoism分析可用于組間差異顯著性檢驗(yàn)，來判斷組間差異是否大于組內(nèi)差異。Anoism分析結(jié)果(圖1B)顯示，R=0.463(P=0.001)，說明應(yīng)激組和對照組的組間差異大于組內(nèi)差異，兩組組間差異具有極顯著性。主坐標(biāo)分析和Anoism分析均說明應(yīng)激組和對照組大鼠的菌群結(jié)構(gòu)之間存在差異。

圖1 菌群結(jié)構(gòu)分析(A)主坐標(biāo)分析；(B)Anoism分析

3.2 物種多樣性分析通過檢驗(yàn)應(yīng)激組和對照組α多樣性的六種指數(shù)(observed species指數(shù)、shannon指數(shù)、simpson指數(shù)、chaol指數(shù)、ACE指數(shù)、PD whole tree指數(shù))，可以描述測序結(jié)果單個樣品多樣性，并進(jìn)行組間差異分析。從圖2可以看出，應(yīng)激組六種指數(shù)均低于對照組，其中，除shannon指數(shù)和simpson指數(shù)外，兩組其余四個指數(shù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。所以，綜合結(jié)果表明應(yīng)激組的物種多樣性低于對照組。

圖2 六種指數(shù)的組間差異分析與對照組比較:*P<0.05

3.3 物種組成分析門水平上的物種相對豐度圖(圖3A)顯示，在所有樣品中，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔壁菌門(Tenericutes)為優(yōu)勢菌，總占比達(dá)98.79%，其中厚壁菌門(Firmicutes)為最明顯的優(yōu)勢菌(81.82%)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔壁菌門(Tenericutes)分別占9.44%和7.52%。此外，與對照組相比，應(yīng)激組大鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)和柔壁菌門(Tenericutes)相對豐度較高，擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度較低。根據(jù)物種豐度選取排名前10的物種，并做其與樣品的聚類熱圖，由此得到的聚類熱圖可以直觀看出在兩組中哪些物種豐度較高。 物種豐度聚類熱圖(圖3B)顯示，除三種優(yōu)勢菌外，應(yīng)激組大鼠腸道菌群中放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和無法確定的分類的細(xì)菌(unidentified Bacteria)的相對豐度高于對照組，變形菌門(Proteobateria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和廣古菌門(Euryarchaeota)相對豐度較低。物種相對豐度圖和聚類熱圖均說明應(yīng)激組和對照組大鼠腸道菌群物種組成存在顯著差異。

圖3 物種組成分析(A)物種相對豐度圖；(B)聚類熱圖

4 討論

腸道菌群種類繁多，數(shù)量巨大，人體自身細(xì)胞數(shù)量僅為腸道細(xì)菌數(shù)量的十分之一。腸道菌群在生理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，參與營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維生素和氨基酸的合成、能量供應(yīng)、消化道免疫、藥物和毒物的代謝、腸道生物屏障等多項(xiàng)生理功能〔9〕。當(dāng)腸道穩(wěn)態(tài)被一系列內(nèi)外因素打破，例如宿主的生理發(fā)育狀態(tài)、生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)等改變，腸道菌群的生存環(huán)境會產(chǎn)生變化，其構(gòu)成和功能也會發(fā)生改變，從而引起各種菌群失調(diào)癥狀。研究證明，機(jī)體和腸道微生物及其代謝產(chǎn)物通過神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫途徑相互調(diào)節(jié)，從而維持腸道微生態(tài)平衡〔10〕。 此外，“微生物-腦-腸軸”學(xué)說已經(jīng)得到了分子生物學(xué)方面的證實(shí)〔11〕。腸道菌群失衡會引起2型糖尿病、腸炎、癌癥和抑郁等各種疾病，對人類健康有很大影響〔12-13〕。腸道菌群的組成與抑郁之間存在密切關(guān)聯(lián)。Davis等人〔14〕發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌種豐度的增加與小鼠抑郁樣行為(如快感缺乏)的增加有關(guān)。研究表明，與正常受試者相比，重度抑郁癥患者的腸道菌群中，Eggerthella、Holdemania和Gelria等菌屬顯著增加，而Prevotella和Dialister菌屬顯著減少〔15〕。同時，重癥抑郁癥患者的抑郁行為和生理特征會隨著其腸道菌群的移植而轉(zhuǎn)移〔16〕。

本研究選取的CUS模型利用長期且不可預(yù)知的刺激引發(fā)動物抑郁行為，其機(jī)制接近人類抑郁癥〔17〕。經(jīng)CUS造模后，大鼠的糖水偏好率顯著下降說明其出現(xiàn)快感缺失癥狀，抑郁大鼠模型建立成功。隨后，采取16S rDNA測序的方法分析抑郁大鼠腸道菌群的變化。首先進(jìn)行了主坐標(biāo)分析和Anoism分析，證明了抑郁大鼠和正常大鼠的菌群結(jié)構(gòu)之間存在差異。其次，α多樣性分析說明了抑郁大鼠腸道菌群的物種多樣性低于正常大鼠。與之類似，研究證明，腸炎等腸道疾病會導(dǎo)致腸道菌群物種多樣性顯著降低〔12〕。第三，通過物種組成分析發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠腸道菌群中厚壁菌門(Firmicutes)和柔壁菌門(Tenericutes)的相對豐度較高，擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度較低。許多研究證明擬桿菌門(Bacteroidetes)作為腸道菌群中的優(yōu)勢菌群，與抑郁癥存在密切關(guān)聯(lián)〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes)的增加和擬桿菌門(Bacteroidetes)的減少與抑郁的發(fā)生有關(guān)，這與一項(xiàng)重癥抑郁患者腸道菌群的研究結(jié)果一致〔19〕。

腸道菌群作用于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，通過多種直接或間接的方式調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致宿主精神行為改變，從而引發(fā)或加重抑郁。腸道微生物的代謝產(chǎn)物作為神經(jīng)遞質(zhì)或者其前體作用在腸道上皮細(xì)胞上，調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的內(nèi)分泌或旁分泌功能。同時，腸道菌群的的變化會引起腸腔局部環(huán)境的改變，腸道的淋巴細(xì)胞感受到變化后釋放細(xì)胞因子進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔8〕。此外，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞釋放的腸肽可以刺激感覺神經(jīng)元末梢，從而產(chǎn)生一系列神經(jīng)沖動進(jìn)入大腦〔20〕。

腸道菌群廣泛參與調(diào)控人體多種生理功能，影響人體身心健康，本研究以抑郁大鼠為模型，研究其腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠腸道微生態(tài)紊亂，菌群失調(diào)，物種多樣性顯著降低，為基于腸道菌群研究抑郁的發(fā)展機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。