李雅倩，周逸丹，陳娜，朱蘭*

臨床上許多生殖道疾病包括先天性生殖道畸形、外傷腫瘤等，都會(huì)造成陰道正常解剖和功能的異常，嚴(yán)重影響患者身心健康。目前利用其他組織進(jìn)行陰道重建手術(shù)是主要治療方法，其中包括自體組織移植，但自體組織陰道重建有體表切口、感染、影響外觀等缺點(diǎn)[1-3]，因此，臨床急需可替代患者自體組織的修復(fù)材料。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過脫細(xì)胞技術(shù)得到的同種異體(人尸體來源)及異種(通常是豬小腸黏膜下組織或牛心包)脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片逐漸引入修復(fù)手術(shù)[4-5]。同種異體生物補(bǔ)片由于倫理等問題而使其來源受限，異種移植物因種屬來源、組織部分等因素影響其體內(nèi)的降解、并發(fā)癥和治療效果，研究報(bào)道其臨床研究效果尚有爭議[6-9]。本研究旨在探討一種豬皮來源的脫細(xì)胞基質(zhì)(acellular tissue matrix,ATM)補(bǔ)片在小型豬陰道重建中的作用，通過在小型豬陰道缺損模型中的實(shí)驗(yàn)研究，一方面評價(jià)該生物補(bǔ)片在體內(nèi)的降解情況和炎癥反應(yīng)，另一方面評價(jià)其使陰道組織再生的能力，從而為人工陰道成形手術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為中國小型實(shí)驗(yàn)豬，共6只，雌性，4～6月齡，均性成熟，未孕未產(chǎn)，體重為(25±5)kg。由北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，單圈飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 研究中使用的組織工程生物補(bǔ)片是一種國產(chǎn)脫細(xì)胞基質(zhì)材料，來源于豬皮，通過脫細(xì)胞處理后去掉細(xì)胞成分且天然細(xì)胞外基質(zhì)成分及其三維空間構(gòu)象被保留；包裝在無菌生理鹽水中，保存在4℃。

1.1.3 主要試劑 AE1/AE3單克隆抗體，α-actin單克隆抗體，Laminin單克隆抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，組織固定液，HE染液，VG染色購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他常用化學(xué)試劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小型豬陰道缺損模型的構(gòu)建和補(bǔ)片的植入 小型豬在麻醉狀態(tài)下行陰道切除術(shù)以制備陰道缺損模型。之后，陰道外口環(huán)切，向上分離陰道“袖口”；同時(shí)將生物補(bǔ)片裁成合適大小，并制成一端閉合，另一端敞開的“套袖”，在補(bǔ)片表面間斷性做6處1 cm長度的縱形切口，以利于引流。將補(bǔ)片塞入陰道腔穴內(nèi)并保證補(bǔ)片和腔穴的粗糙面無間隙地緊貼，最后補(bǔ)片頂端縫合于子宮體段端，下端縫合于陰道前庭黏膜周圍，完成陰道缺損和重建的模型。

1.2.2 HE染色觀察陰道組織大體形態(tài)和炎癥反應(yīng)的情況 在術(shù)后1、2、4、6、8周時(shí)分別取材陰道全層并用組織固定液固定，進(jìn)行石蠟包埋后切片，每片厚度約5 μm，以用于組織形態(tài)學(xué)評價(jià)。組織切片按照常規(guī)步驟進(jìn)行脫蠟后分別進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，并于鏡下進(jìn)行組織形態(tài)的觀察。

1.2.3 VG染色觀察陰道組織膠原纖維和彈力纖維的生成情況 不同時(shí)間段的組織切片進(jìn)行脫蠟后按照VG染色試劑盒的方法染色，組織經(jīng)VG染色后膠原纖維呈現(xiàn)鮮紅色，肌纖維、細(xì)胞胞質(zhì)和紅細(xì)胞呈現(xiàn)黃色，細(xì)胞核呈現(xiàn)黑色。

1.2.4 免疫組化染色評價(jià)上皮層和平滑肌的生長情況 不同時(shí)間段的組織切片分別進(jìn)行上皮光譜角蛋白AE1/AE3抗體，層粘連蛋白Laminin抗體和平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin抗體的免疫組織化學(xué)的染色，以表征上皮層，基質(zhì)膜成分和平滑肌肌束的生成。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察及生物補(bǔ)片降解情況

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)后未見感染、血腫等并發(fā)癥發(fā)生，不同時(shí)間段取材時(shí)均未見瘺和排斥等發(fā)生，陰道組織的生長狀態(tài)良好。手術(shù)1周后可觀察到陰道空穴內(nèi)有補(bǔ)片的明顯殘留，補(bǔ)片與陰道空穴貼合較緊密，不易分離，陰道黏膜的生長不明顯。2周后，陰道黏膜的生長明顯可見，生物補(bǔ)片不完整。4周后新生黏膜較厚和完整，肉眼觀察其外觀與正常的陰道相似；生物補(bǔ)片不可見。6周后新生陰道的外觀結(jié)構(gòu)接近于正常的陰道黏膜，肉眼不可見未黏膜化的部位。8周后，從外觀觀察其與6周的新生陰道無明顯差異，整個(gè)陰道黏膜的形態(tài)完整均一。結(jié)果初步提示該組織工程生物補(bǔ)片可促進(jìn)陰道黏膜再生。詳見表1。

2.2 陰道重建后上皮生成情況的評價(jià)

2.2.1 HE染色觀察新生上皮細(xì)胞、新生血管情況及炎癥反應(yīng)情況 從HE染色結(jié)果可見，該生物補(bǔ)片重建陰道后，1周時(shí)沒有明顯看到上皮組織的存在，可觀察到粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。2周后陰道上皮層較薄，呈不規(guī)則的排列且疏松，可觀察到淋巴細(xì)胞；4周后陰道上皮層較厚，可見多層結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，多見上皮腳釘突，淋巴細(xì)胞有減少；6周后陰道上皮層較厚，可見多層結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)上皮極性，多見上皮腳釘突，炎癥細(xì)胞較少見；8周時(shí)，新生陰道的上皮結(jié)構(gòu)與正常黏膜相似，炎癥細(xì)胞較少見。結(jié)果表明，該組織工程生物補(bǔ)片可有效生成陰道上皮層。詳見下頁表1和圖1。

表1 生物補(bǔ)片植入到體內(nèi)后的降解和炎癥反應(yīng)等情況評價(jià)

2.2.2 上皮光譜角蛋白AE1/AE3的免疫組化染色 植入補(bǔ)片2周后AE1/AE3的表達(dá)呈現(xiàn)陽性，且隨著陰道重建的時(shí)間延長，陽性表達(dá)程度也相應(yīng)增加。結(jié)果與HE染色的觀察一致。結(jié)果表明，在植入生物補(bǔ)片重建陰道后上皮細(xì)胞的生成。見圖2。

2.2.3 層粘連蛋白Laminin的免疫組化染色 陰道在手術(shù)重建1周后，在表皮層下的基質(zhì)中可以觀察到不連續(xù)棕色條帶，表明Laminin染色結(jié)果陽性，提示陰道內(nèi)形成了基底膜。隨著陰道重建的時(shí)間延長，Laminin的陽性表達(dá)增強(qiáng)。層粘連蛋白屬非膠原糖蛋白，主要在基底膜結(jié)構(gòu)中，其在陰道重建后的基質(zhì)中表達(dá)，間接反映了新生陰道中上皮層的完整性。見圖3(見彩插1)。

2.3 陰道重建后平滑肌和膠原纖維生成情況的評價(jià)

2.3.1 平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin的免疫組化染色 在陰道植入生物補(bǔ)片重建8周后，可觀察到較完整的陰道平滑肌肌束，且肌束排列較整齊。結(jié)果表明該組織工程生物補(bǔ)片的植入可有效生成陰道平滑肌層。見圖4。

2.3.2 VG染色 在陰道重建8周后可觀察到呈現(xiàn)黃色染色的肌纖維以及呈現(xiàn)紅色染色的膠原纖維，且二者的排列較整齊。與平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin的染色結(jié)果一致。見圖4(見彩插1)。

注：植入2周后，新生陰道的上皮層較薄；4周后新生陰道的上皮呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)，且上皮極向恢復(fù)，排列較為松散；6周后新生陰道的上皮呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)且上皮極向恢復(fù)，上皮呈現(xiàn)緊密排列；8周后新生陰道的上皮排列情況及結(jié)構(gòu)與正常陰道黏膜類似。

圖1組織工程生物補(bǔ)片重建陰道的不同時(shí)間段的HE染色，×200

注：AE1/AE3蛋白的陽性染色在植入補(bǔ)片第2周后出現(xiàn)，且隨著陰道重建的時(shí)間延長，陽性表達(dá)的程度也相應(yīng)增加。

3 討論

目前臨床上應(yīng)用于陰道重建的方式有很多，包括最早應(yīng)用的刃厚皮片移植以及來源于大陰唇、大腿內(nèi)側(cè)皮片、腹膜、腸管等部位的陰道成形術(shù)，但往往有陰道再狹窄，移植物縮短，瘢痕，潤滑不足，鱗狀細(xì)胞癌等并發(fā)癥的發(fā)生[10-11]。最常用的乙狀結(jié)腸代陰道成形術(shù)的性生活滿意率很好，但由于需要腹部手術(shù)而有腸管阻塞、炎癥性腸病、脫垂、二次手術(shù)等風(fēng)險(xiǎn)[12-14]。近來，研究較多的自體口腔黏膜陰道成形術(shù)有較好的陰道重建效果，但仍需進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證[11,15]。鑒于現(xiàn)有陰道成形術(shù)的不足，臨床上仍需研究開發(fā)新的陰道替代和重建方法。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，其為臨床上的各種陰道缺失缺陷提供了新的治療方法。有研究報(bào)道活檢取得的陰道細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)數(shù)周后形成上皮組織并置于陰道模具上，患者攜帶模具4～6周后可見陰道組織的形成，然而該方法仍需進(jìn)一步研究和臨床驗(yàn)證[16]。近年來，ATM材料在骨骼肌重塑、心肌梗塞的血管再生等的研究尤其是在皮膚損傷的臨床應(yīng)用，給陰道重建帶來啟示[17-20]。目前臨床上應(yīng)用的ATM材料有同種異體(人新鮮尸體)和異種(豬小腸和牛心包等)來源[21]，二者在陰道重建的作用是否有差異，目前尚不明了。既往研究表明人尸皮來源的脫細(xì)胞生物補(bǔ)片在小型豬陰道重建中療效可行[21]。本研究對豬皮來源的脫細(xì)胞生物補(bǔ)片在小型豬陰道缺損模型中的陰道組織再生的性能進(jìn)行了初步評價(jià)，結(jié)果提示同源組織工程生物補(bǔ)片進(jìn)行陰道重建時(shí)可形成完整的陰道黏膜和平滑肌，與正常陰道結(jié)構(gòu)相似，為后續(xù)臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究使用的小型豬模型的陰道黏膜由上皮、固有層和肌層等構(gòu)成，這與人陰道黏膜極為類似[22]，因此本研究選用小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具備可比性。此外，本研究采用的組織工程生物補(bǔ)片來源于豬皮。已有研究表明，除角質(zhì)層外，豬在表皮的組織學(xué)結(jié)構(gòu)、角蛋白的特征、膠原纖維的纖維束和真皮厚度等方面，與人均相似。本研究結(jié)果表明，陰道在植入補(bǔ)片后無明顯粘連、狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生。植入生物補(bǔ)片2周后，大體觀察可見上皮層的出現(xiàn)，提示該組織工程生物補(bǔ)片的上皮化時(shí)間較短。人工陰道重建的一個(gè)重要評價(jià)指標(biāo)是能否快速誘導(dǎo)上皮化，本研究進(jìn)一步從組織形態(tài)學(xué)染色和上皮角蛋白AE1/AE3的染色證明，植入生物補(bǔ)片2周后上皮細(xì)胞標(biāo)志物呈陽性表達(dá)，且隨著重建時(shí)間的延長，陽性表達(dá)增強(qiáng)，4周后上皮層的極性恢復(fù)，8周時(shí)上皮層呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)，與正常陰道黏膜相似。此外，基底膜成分可使上皮細(xì)胞的附著、遷移和分化能力增強(qiáng)，從而有利于補(bǔ)片的上皮化[18,23-25]。本研究結(jié)果顯示，基質(zhì)膜重要成分層粘連蛋白Laminin在補(bǔ)片植入2周后即呈陽性表達(dá)，隨著時(shí)間的延長，陽性表達(dá)趨于均一，提示陰道重建后基底膜成分的生成，一定程度上證明了新生陰道上皮的完整性。與以往研究的人尸皮來源的生物補(bǔ)片相比[26]，該組織工程生物補(bǔ)片在陰道黏膜上皮化的速度和上皮層的形態(tài)結(jié)構(gòu)再生方面達(dá)到相似結(jié)果。

正常陰道由表面的復(fù)層鱗狀上皮，內(nèi)環(huán)外縱排列的平滑肌層和外膜構(gòu)成。研究表明，平滑肌和成纖維細(xì)胞在維持陰道結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。而結(jié)締組織中大量存在的細(xì)胞外基質(zhì)成分尤其是膠原纖維和彈力纖維等與陰道支持作用和組織彈性相關(guān)[27-28]。因此，利用生物補(bǔ)片再生的完整新生陰道組織應(yīng)有平滑肌束和細(xì)胞外基質(zhì)成分。為了評價(jià)再生陰道的組織結(jié)構(gòu)完整性，本研究通過評價(jià)平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin的表達(dá)表明，植入生物補(bǔ)片4周后可見散在的肌纖維，8周后可見較為連續(xù)的平滑肌；同時(shí)8周后膠原纖維的排列較為緊密和整齊，該組織工程生物補(bǔ)片在平滑肌再生方面的性能較好，與以往研究的人尸皮來源的ATM材料達(dá)到類似結(jié)果。

在臨床應(yīng)用時(shí)生物補(bǔ)片的免疫源性也是評價(jià)指標(biāo)之一，以往研究報(bào)道ATM材料由于去掉細(xì)胞成分而大大降低了免疫源性，在本研究的實(shí)驗(yàn)過程中無明顯免疫排斥反應(yīng)發(fā)生，植入生物補(bǔ)片1周后可觀察到炎癥細(xì)胞，但4周后炎癥細(xì)胞明顯減少；表明該組織工程生物補(bǔ)片無明顯的免疫排斥。但本研究采用的動(dòng)物模型與生物補(bǔ)片的來源屬同種，因此在研究補(bǔ)片免疫源性問題上有一定局限性，后續(xù)可在其他動(dòng)物模型上驗(yàn)證并延長觀察時(shí)間。

本研究構(gòu)建小型豬陰道缺損和重建模型，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的圍手術(shù)期和手術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果觀察以及新生陰道的大體和組織形態(tài)學(xué)評價(jià)，闡述了生物補(bǔ)片上皮化的時(shí)間過程，首次證明豬皮來源的組織工程生物補(bǔ)片在豬陰道重建術(shù)后8周即有效快速再生陰道上皮層和平滑肌層，新生陰道結(jié)構(gòu)完整，可作為陰道重建的材料，為同源組織工程生物補(bǔ)片在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，本研究采用的是小型豬作為研究對象，其與臨床仍有一定差距，后續(xù)工作將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和在更接近人體的動(dòng)物身上驗(yàn)證其有效性和安全性，進(jìn)而到人體進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)研究。本研究不足之處在于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)偏少和缺少定量結(jié)果的評價(jià)，后續(xù)研究中需增加功能評價(jià)。