劉清波，張 丹，董和亮，趙思佳，馮文曉，邵美麗,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.齊齊哈爾食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省墾區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江哈爾濱 150030）

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一種應(yīng)用于合成聚丙烯酰胺及其水溶性聚合物的化學(xué)藥品[1]。2002 年，斯德哥爾摩大學(xué)專業(yè)人士和瑞典國家食品管理局（National Food Administration，NFA）研究人員首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)油炸、烘烤高溫處理的淀粉類食品中存在AA[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AA廣泛存在于油炸薯類、早餐谷物、咖啡等食物[3?4]中。國家癌癥組織已將AA劃分為2A級致癌物，AA具有神經(jīng)毒性[5?6]、生殖毒性[7]、遺傳毒性[8]，會引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷，誘導(dǎo)動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體突變及遺傳物質(zhì)改變。鑒于此，通過熱加工食品攝入體內(nèi)的AA會對人體健康產(chǎn)生一定的安全隱患，因此減少食品中AA含量及其造成的危害成為食品安全領(lǐng)域非常值得關(guān)注的問題之一。

目前，去除AA的方法包括物理法、化學(xué)法以及生物法，其中生物法具有天然、安全、高效、低毒、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。生物法中常見吸附劑包括殼聚糖、果皮、益生菌等，但殼聚糖、果皮在未經(jīng)處理應(yīng)用時(shí)，其自身吸附率很低，許多研究人員需要利用改性提高其吸附能力。而乳酸菌作為生物吸附劑直接使用時(shí)，其吸附率高、操作簡單、易于提取且無二次污染。乳酸菌在黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、鉛、汞、鉻等危害物質(zhì)的吸附脫毒方面有廣泛應(yīng)用[9?12]，但在AA吸附脫毒方面研究甚少。本課題組研究證實(shí)乳酸菌對AA具有良好的吸附能力，高壓滅活菌株吸附效果優(yōu)于未經(jīng)滅活菌株，且吸附AA后形成的復(fù)合物在體外胃腸模擬實(shí)驗(yàn)中具有良好的穩(wěn)定性，其中植物乳桿菌對AA的吸附能力優(yōu)于干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌[13]。進(jìn)一步探究乳酸菌吸附AA的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)乳酸菌吸附AA主要部位是細(xì)胞壁而非胞外多糖和表面蛋白，吸附能力與細(xì)胞壁粗糙程度呈正相關(guān)，即細(xì)胞壁越粗糙，對AA的吸附率越高[14]，且已證實(shí)約占細(xì)胞壁質(zhì)量90%的肽聚糖（Peptidoglycan，PG）是乳酸菌吸附AA的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[15]。但有關(guān)乳酸菌PG吸附AA的影響因素及在胃腸環(huán)境下的吸附狀況尚有待進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4 株乳酸菌PG為研究對象，以吸附率為指標(biāo)，探究不同影響因素（PG濃度、AA濃度、時(shí)間、pH、溫度及離子濃度）及人工模擬胃腸環(huán)境下乳酸菌PG對AA吸附能力的影響，旨在了解不同乳酸菌PG對AA的吸附特性，為AA生物脫毒應(yīng)用提供理論支撐，同時(shí)為AA的去除提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌1.0665（L.plantarum1.0665）、干酪乳桿菌ATCC393（L.caseiATCC 393）、嗜酸乳桿菌KLDS 1.0307（L.acido PhilusKLDS 1.0307）、嗜熱鏈球菌 KLDS1.0316（Streptococcus thermophilusKLDS 1.0316）均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌種庫保存；丙酮、乙腈 色譜純，哈爾濱市志飛生物技術(shù)公司；MRS培養(yǎng)基、三氯乙酸（TCA）（分析純）北京奧博星生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺（acrylamide，AA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）美國Amresco公司；冰醋酸（分析純）、胰蛋白酶（250 U/mg）、Tris-Hcl、中性蛋白酶（30000 U/mg）哈爾濱市美萊生物科技有限公司。

LC-20A高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；DL-360A超聲破碎儀 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋 常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HVE-50 高壓滅菌鍋 浙江德育制造有限公司；DHP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱 江蘇中坤儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 人工胃液：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸加去離子水稀釋調(diào)整至pH值分別為1.5、2.5、3.5，然后加入胃蛋白酶，充分溶解后，用0.22 μm濾膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

膽鹽溶液：分別用無菌去離子水配制0.1%、0.2%、0.3%、0.4%牛膽鹽溶液，用0.22 μm的濾膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

胰蛋白酶溶液：稱取6.8 g KH2PO4，溶解于500 mL無菌去離子水中，調(diào)節(jié)pH至6.8，并定容至l000 mL，然后向溶液中添加胰蛋白酶，使溶液終濃度為1 g/100 mL，充分溶解后，用0.22 μm的濾膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.2 PG的提取 將活化好的植物乳桿菌1.0665（Lactobacillus plantarum1.0665）、干酪乳桿菌ATCC393（Lactobacillus caseiATCC 393）、嗜酸乳桿菌KLDS 1.0307（Lactobacillus acidophilusKLDS 1.0307）和嗜熱鏈球菌 KLDS 1.0316（Streptococcus thermophilusKLDS 1.0316）四株菌以3%～4%的接種量接入到50 mL MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h后離心（4 ℃，8000 r/min）5 min，收集菌體，用無菌去離子水離心洗滌兩次。然后按1:10 向菌體中加入10%三氯乙酸（TCA），搖勻后置100 ℃沸水中攪拌20 min，冷卻后6000 r/min，4 ℃離心10 min，沉淀用無菌去離子水洗滌后，加入2 倍體積氯仿：甲醇（1:2，V/V）振蕩6 h，并于6000 r/min，4 ℃離心10 min，再次洗滌沉淀，并將其溶于含有3 mg/mL胰蛋白酶和10 mg/mL中性蛋白酶的0.1 mol/L pH7.6 的Tris-HCl緩沖液中，37 ℃，150 r/min搖床振蕩過夜，然后8000 r/min離心20 min收集沉淀并洗滌后，經(jīng)凍干機(jī)冷凍干燥，得到粉末狀PG提取物[17?20]。

1.2.3 PG鑒定 稱取一定質(zhì)量的上述PG凍干粉末，加入濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH為6.2）中，將其配制成濃度為1 mg/mL的溶液，再加入溶菌酶，將其濃度調(diào)整為300 μg/mL，同時(shí)以不加溶菌酶的PG作為對照組。于37 ℃振蕩12 h，期間每間隔1 h進(jìn)行一次取樣，稀釋5 倍后在600 nm波長下測定其吸光度值，觀察肽聚糖的溶解狀況[17]。

1.2.4 PG純度的測定 采用高效液相色譜法進(jìn)行PG純度的測定，檢測條件：色譜柱：色譜柱為Alltima Inertsil ODSP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長：225 nm，柱溫：37 ℃，流動(dòng)相：H2O，流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。樣品處理：將肽聚糖樣品溶于無菌去離子水配制成1 mg/mL的PG溶液。根據(jù)肽聚糖在色譜圖上的峰面積比來鑒定肽聚糖的純度。

1.2.5 各因素對PG吸附AA的影響

1.2.5.1 pH對PG吸附AA的影響 將PG凍干粉溶于去離子水制備5 mg/mL的PG溶液，且分別調(diào)節(jié)pH為3、5、7、9、11。取900 μL該P(yáng)G溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，于37 ℃作用6 h，然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.5.2 溫度對PG吸附AA的影響 將PG凍干粉溶于去離子水制備5 mg/mL的PG溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為5。取900 μL該P(yáng)G溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，分別在4、20、37、50 ℃下作用6 h，然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.5.3 時(shí)間對PG吸附AA的影響 將PG凍干粉溶于去離子水制備5 mg/mL的PG溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為5。取900 μL該P(yáng)G溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，37 °C，分別與AA作用2、4、6、8、10 h，然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.5.4 PG濃度對PG吸附AA的影響 分別稱取5、10、15、20、25 mg肽聚糖凍干粉于1 mL無菌去離子水中，分別制備5、10、15、20、25 mg/mL的PG溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為5。取900 μL該P(yáng)G溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，于37 ℃作用6 h。然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.5.5 AA濃度對PG吸附AA的影響 將PG凍干粉溶于去離子水制備5 mg/mL的PG溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為5。取900 μL該P(yáng)G溶液分別與不同濃度的AA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）100 μL混勻，于37 °C作用6 h。然后離心（4 °C，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.5.6 鈣離子濃度對PG吸附AA的影響 將PG凍干粉分別溶于濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L的鈣離子溶液，使PG終濃度為5 mg/mL。取900 μL該P(yáng)G溶液與6 μg/m AA 100 μL混勻，于37 ℃作用6 h。然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.6 模擬胃腸環(huán)境條件下PG吸附AA的影響

1.2.6.1 模擬胃環(huán)境 將PG凍干粉分別溶于不同pH（1.5、2.5、3.5）的人工胃液制備5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相應(yīng)PG溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，37 ℃，分別作用2、4、6、8 h。然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.6.2 模擬腸環(huán)境 a.膽鹽濃度對PG吸附AA的影響：將PG凍干粉分別溶于不同濃度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）牛膽鹽溶液，制備5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相應(yīng)PG溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，37 ℃，分別作用2、4、6、8 h，然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

b.胰蛋白酶對PG吸附AA的影響：將PG凍干粉分別溶于胰蛋白酶溶液制備5 mg/mL的PG溶液。取900 μL相應(yīng)PG溶液與6 μg/mL AA 100 μL混勻，37 ℃，分別作用2、4、6、8 h，然后離心（4 ℃，8000 r/min，5 min），收集上清液。按照1.2.7 測定PG對AA的吸附率，重復(fù)操作三次。

1.2.7 PG對AA的吸附率的測定 采用高效液相色譜法，檢測條件：色譜柱為Alltima Inertsil ODSPC18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為5%甲醇溶液，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，紫外檢測波長為205 nm。PG與AA反應(yīng)離心后，測定所回收上清液中AA的含量，并按式（1）計(jì)算PG對AA的吸附率。以不加PG溶液的AA工作液為空白對照（AA含量的測定方法如上）。

式中：C0：空白樣液中AA的含量，μg；Ce：加入AA的菌懸液經(jīng)離心收集的上清液中AA的含量，μg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

溶菌酶是一種能夠水解致病菌中粘性多糖的堿性酶，它主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，溶菌酶能夠破壞N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸這兩種結(jié)構(gòu)之間的β-1,4 糖苷鍵，從而水解肽聚糖。研究表明，溶菌酶能夠識別細(xì)菌肽聚糖，常用于鑒定肽聚糖[21]。本研究的溶菌酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1 中可以看出，隨著溶菌酶試驗(yàn)的不斷進(jìn)行，四種溶液的吸光度均逐漸降低，最終趨于平衡，其中，植物乳桿菌1.0665 的PG溶液、干酪乳桿菌ATCC 393 的PG溶液和嗜酸乳桿菌KLDS 1.0307 的PG溶液的吸光度均在8 h左右趨于平衡，而嗜熱鏈球菌KLDS 1.0316的PG溶液的吸光度在10 h左右趨于平衡。以上說明提取物能夠被溶菌酶完全水解，所提取的物質(zhì)是肽聚糖。

圖1 四株乳酸菌PG溶菌酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Lysozyme assay observed from peptidoglycans from four lactic acid bacteria

2.2 PG純度測定結(jié)果

PG純度鑒定結(jié)果如圖2 所示，從圖2可知，所提取的四株菌的肽聚糖樣品峰面積百分比為98%～99%，證明所提取的肽聚糖樣品純度高。

圖2 四種PG的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of four PG

2.3 各因素對PG吸附AA的影響

2.3.1 pH對PG吸附AA的影響 由圖3 可知，同一菌株P(guān)G在不同pH下對AA的吸附性存在顯著差異（P<0.05）。隨著pH的增大，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH為5 時(shí)，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率均達(dá)到最大值，其中植物乳桿菌1.0665 的PG吸附率最大，可達(dá)87.35%。當(dāng)pH>5 后，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率逐漸降低，在pH為11 時(shí)，PG對AA吸附率最低，其范圍為18.59%～51.25%。這說明酸性條件有助于PG對AA的吸附。寧妍[22]研究表明pH對PG分子某些結(jié)構(gòu)的水解產(chǎn)生一定的影響，具體體現(xiàn)在一部分肽鍵發(fā)生水解，游離的羧基和氨基發(fā)生變化，另外水解為臨近多肽鏈的結(jié)合作用提供了更多的空間，使其結(jié)合更易發(fā)生。且PG肽鏈上的第三位氨基酸是內(nèi)消旋二氨基庚二酸型，且含有丙氨酸、谷氨酸等氨基酸。其中，二氨基庚二酸、谷氨酸及丙氨酸中的部分羧基可發(fā)生電離[23]。因此，pH影響了PG結(jié)構(gòu)的變化，影響著基團(tuán)的解離，進(jìn)一步影響了PG表面結(jié)合位點(diǎn)的暴露，引起吸附率明顯變化。

圖3 不同pH對PG吸附AA的影響Fig.3 Effects of different pH on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.3.2 溫度對PG吸附AA的影響 由圖4 可知，同一菌株的PG在不同的溫度下對AA的吸附率存在顯著差異（P<0.05）。隨著溫度增高，4 株乳酸菌的PG對AA的吸附率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，4 株菌的PG對AA的吸附率均達(dá)到最大，其中植物乳桿菌1.0665 的PG對AA吸附率達(dá)87.35%，顯著高于其它3 株菌PG（P<0.05）。PG是由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸與4～5 個(gè)氨基酸短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。PG對溫度敏感，因此溫度會影響PG結(jié)構(gòu)變化，使PG的交聯(lián)度發(fā)生變化，結(jié)合位點(diǎn)暴露發(fā)生變化，進(jìn)而其對AA吸附效果發(fā)生明顯變化。

圖4 不同溫度對PG吸附AA的影響Fig.4 Effects of different temperatures on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.3.3 時(shí)間對PG吸附AA的影響 由圖5 可知，在2～6 h內(nèi)，4 株乳酸菌的PG對AA的吸附率均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增大，并且存在顯著性差異（P<0.05），其中，植物乳桿菌1.0665 的PG對AA的吸附率增長最快，共升高了37.58%。當(dāng)反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行時(shí)，4 株菌的PG對AA的吸附率隨時(shí)間的增長變得平緩，且差異不顯著（P>0.05）。這與Jin等、Wang等[24?25]利用生物吸附法去除重金屬發(fā)現(xiàn)的時(shí)間對吸附作用的影響規(guī)律相似，分析原因可能是前期PG表面存在大量的吸附位點(diǎn)，吸附速率較快，隨著時(shí)間的逐漸延長，表面吸附結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，從而吸附過程逐漸平緩，因此本實(shí)驗(yàn)中AA吸附最適宜時(shí)間為6 h。

圖5 不同時(shí)間對PG吸附AA的影響Fig.5 Effects of different time on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.3.4 PG濃度對PG吸附AA的影響 如圖6 所示，同一菌株的PG對AA的吸附率均隨著PG濃度的升高而增加，但差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)PG濃度相同時(shí)，4 株乳酸菌的PG對AA吸附率有顯著性差異（P<0.05）。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)PG吸附AA前后，其C-O、C=O和N-H這三種官能團(tuán)的波數(shù)發(fā)生了明顯改變，說明四株乳酸菌PG中的這三種官能團(tuán)參與了其對AA的吸附。因此，推測當(dāng)PG濃度為5 mg/mL時(shí)，PG上的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)開始飽和，隨著PG濃度的增加，對AA的吸附效果影響不明顯。

圖6 不同PG濃度對PG吸附AA的影響Fig.6 Effects of different peptidoglycan concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.3.5 AA濃度對PG吸附AA的影響 由圖7 可知，同一種菌株的PG在不同AA濃度條件下對AA吸附率具有顯著性差異（P<0.05）。AA濃度在0.2～1 μg/mL范圍內(nèi)，4 株乳酸菌的PG對AA的吸附率隨著AA濃度的增大而降低。當(dāng)AA濃度達(dá)1 μg/mL時(shí)，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率均最低。這與Gungal等[26]研究溶液中重金屬吸附特性基本一致，Gungal認(rèn)為這與吸附位點(diǎn)的飽和有關(guān)。因此推測AA濃度為0.2 μg/mL時(shí)，PG表面吸附位點(diǎn)開始飽和，由此之后隨著AA濃度的增加，吸附率逐漸減小。

圖7 AA濃度對PG吸附AA的影響Fig.7 Effects of acrylamide concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.3.6 鈣離子濃度對PG吸附AA的影響 由圖8可見，在 0～0.6 mol/L鈣離子濃度范圍內(nèi)，4 株菌的PG對AA的吸附率均隨著鈣離子濃度的增加而顯著增大（P<0.05），當(dāng)鈣離子濃度為0.6 mol/L時(shí)，4 株菌的PG對AA的吸附率達(dá)到最大，其中植物乳桿菌1.0665 的PG對AA的吸附率最高，約為87.18%。當(dāng)鈣離子濃度繼續(xù)增大至1 mol/L時(shí)，PG對AA的吸附率變化不顯著（P>0.05）。

圖8 不同鈣離子濃度對PG吸附AA的影響Fig.8 Effects of Ca2+ concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.4 人工模擬胃環(huán)境對PG吸附AA的影響

由表1 可知，在不同pH的人工胃液中，4 株乳酸菌的PG對AA吸附率呈顯著差異（P<0.05），但相同pH、不同作用時(shí)間條件下，4 株乳酸菌的PG對AA的吸附能力基本上沒有呈現(xiàn)顯著性差異（P>0.05），這表明4 株乳酸菌的PG對AA的吸附特性受pH影響很大，但與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系不大。在同一吸附時(shí)間下，4 株乳酸菌的PG均在pH為3.5 時(shí)對AA的吸附率最高。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，胃液中乳脂鏈球菌的細(xì)胞對致突變物質(zhì)的吸附能力受pH的顯著影響。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PG的AA的吸附率在模擬胃環(huán)境實(shí)驗(yàn)中受pH影響顯著。Zhao等[28]發(fā)現(xiàn)pH顯著影響植物乳桿菌對伏馬菌素的結(jié)合作用，其原因是pH影響PG之間糖苷鍵水解，進(jìn)而影響其結(jié)構(gòu)變化。因此，推測pH通過影響PG結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其表面基團(tuán)暴露，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量發(fā)生改變，從而影響吸附效果。

表1 人工胃環(huán)境對4 種PG吸附AA的影響Table 1 Effects of artificial gastric juice on acrylamide bound by the four peptidoglycans

2.5 人工模擬腸環(huán)境

2.5.1 膽鹽濃度對PG吸附丙烯酰胺的影響 研究發(fā)現(xiàn)[29?30]，膽鹽對于細(xì)菌的蛋白質(zhì)和磷脂具有破壞作用。膽鹽的這種破壞作用有可能會影響肽聚糖的蛋白及其氨基酸的結(jié)構(gòu)，從而影響肽聚糖對丙烯酰胺的吸附作用。而本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的PG對AA吸附率受膽鹽影響較大。由表2 看出，相同時(shí)間下，同一PG在不同濃度膽鹽處理后，其對AA的吸附率存在差異，其中，嗜酸乳桿菌KLDS1.0307及嗜熱鏈球菌KLDS1.0316 的PG對AA的吸附率的最高值均出現(xiàn)在0.3%膽鹽濃度條件下，而植物乳桿菌1.0665和干酪乳桿菌ATCC393 的PG對AA的吸附率最大值出現(xiàn)在0.4%膽鹽濃度條件下，這說明0.3%～0.4%膽鹽濃度條件下更有利于乳酸菌的PG對AA的吸附；此外，在膽鹽濃度相同時(shí)，不同吸附時(shí)間下，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率也存在差異，這說明作用時(shí)間對4 株乳酸菌的PG吸附AA的能力也產(chǎn)生了較大影響，其中植物乳桿菌1.0665 PG對AA的吸附率在0.4%膽鹽濃度條件下，處理4 h后達(dá)到最高，為84.67%。

表2 膽鹽濃度對4 種PG吸附丙烯酰胺的影響Table 2 Effects of bile salt concentrations on acrylamide bound by the peptidoglycans

2.5.2 胰蛋白酶作用時(shí)間對PG吸附AA的影響 由表3 可知，經(jīng)胰蛋白酶處理時(shí)，同一種菌株的PG對AA的吸附率并沒有隨時(shí)間變化而顯著改變，說明胰蛋白酶對4 株乳酸菌的PG吸附AA的能力沒有顯著影響（P>0.05）。而漆葉瓊[16]在探究乳酸菌吸附苯并芘過程中，證明了PG是乳酸菌吸附苯并芘的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶處理時(shí)，隨處理時(shí)間不同，有些菌株的吸附率呈極顯著差異，而有些菌株吸附率并未受到影響。進(jìn)一步證實(shí)胰蛋白酶對乳酸菌吸附能力的影響具有菌株特異性。

表3 胰蛋白酶作用時(shí)間對4 種PG吸附AA的影響Table 3 Effect of trypsin action time on the adsorption of AA by 4 PG

3 結(jié)論

因AA廣泛存在于人們常用的食品中，其對人體健康又存在安全隱患，因此對AA進(jìn)行生物脫毒的研究是必要的，而在生物脫毒的過程中，一些因素對脫毒效果產(chǎn)生的影響是不可忽視的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4 株乳酸菌的PG對AA均具有良好的吸附效果，其中植物乳桿菌1.0665 的PG吸附效果最好。6 種影響因素（pH、溫度、時(shí)間、PG濃度、AA濃度及鈣離子濃度）均對PG吸附AA具有一定的影響。其中pH、溫度以及AA濃度對PG吸附AA具有明顯影響，吸附率隨著pH及溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，且隨著AA濃度的升高而減少。在6 h以內(nèi)，4 株乳酸菌PG對AA的吸附率隨時(shí)間的延長而顯著增加（P<0.05），但6 h后無顯著性變化。在0.6 mol/L以內(nèi)，吸附率隨著鈣離子濃度的增大而顯著增加（P<0.05)。而PG濃度對同一菌株P(guān)G吸附AA不具有顯著性。模擬胃環(huán)境下，不同pH明顯影響著PG對AA的吸附效果，反應(yīng)時(shí)間沒有明顯影響。模擬腸環(huán)境下，膽鹽濃度和反應(yīng)時(shí)間均顯著影響PG對AA的吸附效果，而胰蛋白酶對PG吸附AA的能力沒有顯著影響。以上結(jié)果為AA的生物脫毒奠定了基礎(chǔ)并提供理論支撐。