賈顏鋒，陳 偉

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710061；2.西安交通大學(xué)附屬西安市人民醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710004

在創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后繼發(fā)的復(fù)雜病理生理進程中，受損腦組織產(chǎn)生的興奮性氨基酸過量聚集，可通過作用于神經(jīng)元細胞膜N-甲基-D-天門冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid，NMDA) 受體，引起興奮性神經(jīng)毒損傷和細胞凋亡，是造成TBI后神經(jīng)功能障礙的重要因素[1-2]。研究表明，細胞表面的NMDA受體2B亞基 (NMDA receptor 2B,NR2B) 磷酸化水平與表達量越高，其對興奮性氨基酸的毒損傷易感性越強[3-4]。因此，抑制TBI后NR2B與磷酸化NR2B (Phosphorylated NR2B，pNR2B) 表達水平，可能是阻止NMDA受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒損傷以及連鎖效應(yīng)的有效途徑。

羥基積雪草苷(madecassoside,MC)是提取自傘形科植物積雪草的三萜類化合物，是積雪草的主要藥理活性成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、促進創(chuàng)面愈合等多種功效[5-6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，MC對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和缺血性疾病具有神經(jīng)保護作用[7]。然而，MC對顱腦損傷的實驗研究未見報道。本文通過建立大鼠TBI模型，觀察MC對顱腦損傷后神經(jīng)功能障礙的改善作用，并從興奮性毒損傷效應(yīng)引起神經(jīng)元凋亡的角度初步探討MC的可能作用機制，為其應(yīng)用于TBI的腦保護治療提供新的研究依據(jù)。

材料與方法

1 主要設(shè)備與試劑

控制性皮層損傷打擊裝置(美國Hatteras 公司)；免疫印跡電泳裝置(美國Bio-Rad公司)；NR2B抗體和pNR2B抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma，Bcl-2)基因抗體、半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗體和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax) 抗體(美國CST公司)；β-actin抗體(美國Thermo Fisher公司)；Western-blotting檢測試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)；羥基積雪草苷 (南京道斯夫生物科技有限公司)。

2 實驗分組與給藥方法

SPF級雄性SD大鼠64只(200～220g/只)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為四組：假創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷后低劑量MC治療組(25mg/kg)、創(chuàng)傷后高劑量MC治療組(75mg/kg)。MC溶解于0.9%氯化鈉注射液中，低劑量MC組與高劑量MC組大鼠在傷后1h時尾靜脈注射給藥干預(yù)，此后每日在相同時點尾靜脈給藥1次，連續(xù)28d。本研究大鼠飼養(yǎng)和實驗過程均嚴格遵守實驗動物倫理規(guī)定，獲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗倫理委員會批準(XJTU-M202001295a)。

3 建立大鼠TBI模型

以2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠(60mg/kg)，沿中線縱行切開頭頂皮膚，剝離骨膜，于人字縫尖與前囟的中點右偏4mm處，牙科鉆開一直徑為3mm的顱骨骨窗，顯露硬腦膜。連接控制性皮層損傷裝置，將大鼠固定于打擊臺上，調(diào)整打擊棒位置，使其尖端接觸至硬腦膜表面，實施皮層打擊致傷，打擊速度為4.0m/s、致傷深度2.0mm、接觸時間為120ms，完成打擊后予以縫合頭皮。假損傷組大鼠僅縱形切開頭皮后縫合，不予以實施打擊。

4 蛋白免疫印跡檢測(Western-blotting)

大鼠傷后28d處死，采用Western-blotting檢測各組大鼠皮層損傷區(qū)NR2B、 pNR2B、Bcl-2、Caspase-3和Bax的表達水平。以2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠(60mg/kg)，快速斷頭取腦，冰上分離獲得皮層損傷區(qū)腦組織。冰浴條件下裂解、勻漿、提取總蛋白。采用蛋白質(zhì)定量法(BCA法)蛋白定量后，上樣進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉溶液封閉1h后，TBST洗滌3次，每次8min。分別加入NR2B一抗(1∶1000)、pNR2B一抗(1∶800)、Bcl-2一抗(1∶2000)、Caspase-3一抗(1∶1000)、Bax一抗(1∶2000)和β-actin一抗(1∶1500)，4℃條件下反應(yīng)過夜，TBST洗滌3次，每次8min。再加入IgG二抗(1∶2000)，室溫條件下反應(yīng)1h，TBST洗滌3次，每次8min。加入顯影液進行發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)分析，測定各目標條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度，得出相對灰度比值。

5 大鼠神經(jīng)功能評分

傷后3、7、14、21和28d，采用改良神經(jīng)功能缺損嚴重程度評分量表(modified neurological severity score，mNSS) 分別對各組大鼠神經(jīng)功能進行評估。根據(jù)該量表評分標準與步驟，依次在不同時點對各組大鼠進行運動實驗、感覺實驗、平衡木實驗和反射實驗[8]。綜合各項實驗得分，分數(shù)越高代表神經(jīng)功能缺損越嚴重，1～6分為輕度功能缺損，7～12分為中度功能缺損，13～18分為重度功能缺損。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 大鼠神經(jīng)功能評分比較

傷后3、7、14、21和28d，創(chuàng)傷組、低劑量MC組與高劑量MC組大鼠在各時點的mNSS評分均高于假創(chuàng)傷組(P<0.05)。傷后3d，創(chuàng)傷組、低劑量MC組與高劑量MC組的評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。傷后7、14、21和28d，低劑量MC組與高劑量MC組的評分均顯著低于創(chuàng)傷組(P<0.05)，并且高劑量MC組評分顯著低于低劑量MC組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，在傷后7、14、21和28d，低劑量MC組與高劑量MC組的評分隨著時間延長逐漸降低，兩組內(nèi)各時點間的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠傷后各時點的mNSS評分比較分)

2 大鼠皮層損傷區(qū)NR2B與pNR2B表達水平

傷后28d，創(chuàng)傷組大鼠皮層損傷區(qū)的NR2B與pNR2B表達量較假創(chuàng)傷組顯著增加。與創(chuàng)傷組相比，低劑量MC組、高劑量MC組兩個給藥組的NR2B與pNR2B表達水平明顯降低。并且高劑量MC組的NR2B與pNR2B表達水平均顯著低于低劑量MC組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠皮層區(qū)NR2B與pNR2B表達檢測結(jié)果

表2 各組大鼠NR2B與pNR2B表達量比較

3 大鼠皮層損傷區(qū)Caspase-3、Bax與Bcl-2表達水平

與假創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠皮層損傷區(qū)域的Caspase-3、Bax與Bcl-2的表達量均增加。與創(chuàng)傷組相比，低劑量MC組與高劑量MC組的Caspase-3與Bax表達水平減少，Bcl-2表達水平明顯增加。兩個給藥組相比，高劑量MC組Caspase-3與Bax的表達水平顯著低于低劑量MC組，Bcl-2的表達水平高于低劑量MC組，組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2與表3。

圖2 各組大鼠皮層區(qū)Caspase-3、Bax與Bcl-2表達檢測結(jié)果

表3 各組Caspase-3、Bax與Bcl-2表達量比較

討 論

隨著現(xiàn)代社會和交通工具的發(fā)展，TBI作為常見的急性創(chuàng)傷，發(fā)生率逐漸升高。TBI以高致殘率和致死率居各類創(chuàng)傷之首，已成為嚴重威脅公共健康的衛(wèi)生問題。雖然救治技術(shù)的進步使TBI病死率顯著下降，但對幸存患者的神經(jīng)功能障礙救治難以令人滿意，尤其是對TBI后多因素參與的繼發(fā)性腦損傷缺乏有效干預(yù)措施[9]。因此，深入研究TBI后繼發(fā)性腦損傷的致傷因素與機制，探討合理可行的治療策略，對改善神經(jīng)功能缺損和促進患者康復(fù)具有重要意義。本研究利用控制性皮層損傷法制備TBI模型，初步發(fā)現(xiàn)MC對TBI具有神經(jīng)保護作用。

MC作為傳統(tǒng)中藥積雪草的主要藥理成分，既往研究證實其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種退行性疾病具有神經(jīng)保護作用[5]。MC可顯著提高側(cè)索硬化小鼠的脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量，減少神經(jīng)元變性，有效改善側(cè)索硬化小鼠的神經(jīng)功能缺陷[7]。MC通過抑制1甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)對多巴胺能神經(jīng)元的毒性損傷作用，減少神經(jīng)元的凋亡，增加紋狀體多巴胺的含量，顯著改善帕金森大鼠的運動功能障礙[10-11]。MC還可抑制腦缺血再灌注損傷時小膠質(zhì)細胞向促炎表型極化，減輕小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少促炎因子的釋放和自由基的產(chǎn)生[12-13]。大鼠脊髓損傷后，MC干預(yù)可顯著提高脊髓組織的超氧化物歧化酶活性，減輕損傷脊髓的水腫程度和神經(jīng)元凋亡數(shù)量[6]。

在TBI后繼發(fā)性腦損傷的病理生理變化中，損傷區(qū)域腦組織興奮性氨基酸大量聚集，結(jié)合至位于神經(jīng)元細胞膜的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，而引起興奮性神經(jīng)毒損傷效應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡、壞死，進而加重繼發(fā)性腦損害[2-4]。構(gòu)成NMDA受體的多個亞單位中，主要調(diào)節(jié)亞單位NR2包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D四個亞基。其中，NR2B亞基作為調(diào)控NMDA受體功能與活性的主要分子，其磷酸化是NMDA受體介導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒損傷過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接決定了神經(jīng)元細胞對興奮性氨基酸毒損傷效應(yīng)的易感性[14-15]。研究表明，抑制NR2B的表達及其磷酸化水平，可有效減輕興奮性氨基酸堆積引起的細胞外鈣離子內(nèi)流超載，以及最終導(dǎo)致的興奮性毒損傷效應(yīng)[4,16]。

本研究利用控制性皮層損傷法建立TBI大鼠模型，首先通過mNSS神經(jīng)功能缺損評分，證實了TBI引起的運動、感覺、反射等神經(jīng)功能障礙。給予MC治療發(fā)現(xiàn)受傷大鼠的神經(jīng)功能障礙明顯改善，而且高劑量MC治療組的效果顯著優(yōu)于低劑量MC治療組。皮層損傷區(qū)NR2B與pNR2B的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI后NR2B表達水平及其磷酸化水平顯著增加，表明傷后皮層區(qū)NR2B被活化，引起興奮性神經(jīng)毒性損傷，可能是導(dǎo)致TBI后神經(jīng)功能障礙和加重繼發(fā)性腦損傷的重要因素。給予MC干預(yù)治療，可顯著抑制NR2B的表達及其磷酸化，改善大鼠的神經(jīng)功能障礙。同樣，筆者發(fā)現(xiàn)，高劑量MC對NR2B介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性損傷抑制效果顯著優(yōu)于低劑量。

神經(jīng)元凋亡是受興奮性毒損傷后的主要死亡原因之一，抑制TBI后神經(jīng)元細胞凋亡發(fā)生、發(fā)展，可有效減輕繼發(fā)性神經(jīng)損害和促進功能恢復(fù)[17-18]。在目前已知的眾多調(diào)節(jié)細胞凋亡分子中，Bcl家族的促進凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2是一對極為重要的調(diào)控分子。Bax與Bcl-2在凋亡進程中的對立功能，使二者的表達水平直接決定了細胞凋亡閾值[19]。在凋亡信號刺激下，Bax構(gòu)象發(fā)生改變，并轉(zhuǎn)位至線粒體破壞膜通透性，引起大量促凋亡因子釋放，激活Caspase-3，進而啟動細胞凋亡和加速凋亡進程[20]。Bcl-2作為抑制細胞凋亡基因，通過與Bax形成異源二聚體，可抑制其轉(zhuǎn)位以及活化Caspase-3的級聯(lián)反應(yīng)，有效阻止細胞凋亡程序啟動[21]。Bcl-2還可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子流向，穩(wěn)定胞內(nèi)鈣離子濃度，組織鈣離子超載進一步加重，阻斷興奮性毒損傷誘發(fā)的細胞凋亡進程[19-21]。

如何減輕興奮性毒損傷引起的神經(jīng)元凋亡，是近年來TBI的腦保護策略研究熱點。本研究在明確TBI后皮層損傷區(qū)NR2B介導(dǎo)的興奮性毒損傷基礎(chǔ)上，進一步對該區(qū)域凋亡相關(guān)分子進行檢測，結(jié)果提示傷后促凋亡分子Caspase-3和Bax表達明顯增加，抗凋亡分子Bcl-2表達顯著下降，表明NR2B活化引起的興奮性毒效應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡。傷后予以大劑量和小劑量MC干預(yù)治療，均能夠有效抑制NR2B活化和神經(jīng)毒性反應(yīng)，下調(diào)促凋亡分子表達和提高抗凋亡分子的表達，逆轉(zhuǎn)TBI后興奮性毒損傷引起的神經(jīng)元凋亡，并且高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組。據(jù)此，筆者推測，MC對顱腦損傷的神經(jīng)保護作用，可能與減輕NR2B介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒損傷及其引起的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

綜上所述，本研究通過建立大鼠TBI模型和給予MC干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)TBI后MC可有效抑制興奮性神經(jīng)毒損傷的重要誘導(dǎo)分子NR2B活化，減輕皮層區(qū)神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能障礙，初步證實了MC對TBI具有神經(jīng)保護作用，為其向臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了更加充分的實驗依據(jù)。但TBI后MC的最佳治療劑量、給藥時間窗和具體作用途徑等仍有待進一步研究。