楊 強，鄭吉松，郎立敏，王 玥，朱曉彤，束 剛，王麗娜，高 萍，江青艷，王松波

(華南農業(yè)大學 動物科學學院/廣東省動物營養(yǎng)調控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

藏豬是少有的高原型地方豬種，是我國寶貴的地方品種資源[1]。據(jù)調查，藏豬產仔數(shù)并不低，母豬的營養(yǎng)水平低下和乳腺發(fā)育不佳以及生存條件較惡劣可能是導致仔豬死亡率高的主要原因[2]。乳腺的良好發(fā)育是正常泌乳的前提，仔豬的存活率與母豬的乳腺發(fā)育密不可分。因此，研究藏豬妊娠期乳腺發(fā)育狀況對于判斷乳腺是否正常發(fā)育以及提高藏豬繁殖能力具有重要意義。

妊娠期是母豬乳腺發(fā)育的關鍵時期，特別是妊娠后1/3階段，即妊娠75 d后，乳腺快速發(fā)育，其質量快速增加，乳腺結構由懷孕初期的以脂肪細胞為主轉化為懷孕后期以導管和腺泡結構為主[3]；妊娠期乳腺發(fā)育受到雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P)、催乳素 (Prolactin，PRL)[4]等激素的調控。E2對于乳腺導管的伸長和分支具有重要作用[5]；P與E2相似，由卵巢分泌，調控乳腺組織的導管分枝、腺泡形成[6]；PRL促進乳腺腺泡的發(fā)育及乳汁的分泌[7-8]。此外，在信號通路方面，PI3K/Akt是細胞內重要的信號轉導通路，在乳腺細胞的增殖、分化、凋亡等活動中發(fā)揮重要的生物學功能[9-11]。Jak2/STAT5信號通路對乳腺腺泡的生成和多種乳汁蛋白基因的轉錄有著重要的調控作用[12-13]。但是，目前對于藏豬妊娠期乳腺的發(fā)育情況及激素和信號通路調控尚不清楚。

本試驗以藏豬為對象，選取妊娠期不同時間點，在研究乳腺發(fā)育形態(tài)的基礎上，進一步探索不同時間點血清中E2、P、PRL的水平，乳腺中激素受體的表達及乳腺發(fā)育關鍵信號通路PI3K/Akt和Jak2/STAT5的變化。研究旨在初步探究妊娠期藏豬乳腺發(fā)育過程及其潛在調控機制，為日后藏豬乳腺發(fā)育規(guī)律的揭示和地方品種的保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

妊娠藏豬選取 4個時間點 (妊娠 33、50、75和90 d)進行屠宰采樣，采集血后離心取血清，采集第3、4對乳腺組織提取蛋白質，取第4對靠近乳頭部乳腺進行石蠟切片染色。

1.2 試驗材料

雌二醇、孕酮和催乳素ELISA試劑盒購于南京建成生物工程有限公司；催乳素受體(Prolactin receptor,PRLR)(貨號：382057)、雌激素受體(Estrogen receptor,ER)(貨號：220467)、孕酮受體(Progesterone receptor, PR)(貨號：220124)抗體購于正能生物有限公司，蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2, Jak2)(貨號：3230)、磷酸化蛋白酪氨酸激酶 2 (p-Jak2)(貨號：3771)、信號轉導及轉錄激活因子5(Signal transducers and activators of transduction 5,STAT5)(貨號：9359)、磷酸化信號轉導及轉錄激活因子 5 (p-STAT5)(貨號：4322)、磷脂酰肌醇三激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)(貨號：4249)、磷酸化磷脂酰肌醇三激酶(p-PI3K)(貨號：4228)、蛋白激酶 B (Protein kinase B, AKT)(貨號：9272)和磷酸化蛋白激酶B (p-AKT)(貨號：4060)抗體購于Cell Signaling Technology公司；蘇木素染液、伊紅染液、蘇木素分化液和蘇木素返藍液購于塞維爾生物公司；BCA蛋白定量試劑盒購自白泰克生物技術有限公司(北京)；ECL化學發(fā)光液購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 測定指標及方法

乳腺采集和HE染色：切下右側乳腺腹腺體(第4對乳腺)，體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

蛋白質免疫印跡 (Western blot)：按照每 10 μg乳腺組織加入100 μL裂解液進行勻漿，試劑盒抽提法提取蛋白質，按照BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，調整蛋白濃度并用5×loading buffer制樣，按照每孔20 μg總蛋白上樣電泳，經電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上后封閉，孵育一抗過夜，并用TBST緩沖液洗凈孵育二抗，TBST緩沖液洗凈后按照ECL化學發(fā)光底物說明書1∶1配置工作液，使PVDF膜與其充分反應30 s，置于曝光儀中曝光顯色并拍照。

血清激素檢測：按照南京建成ELISA試劑盒說明書進行檢測；加入準備好的樣品、標準品和生物素抗原，37 ℃ 條件下反應 30 min；洗板 5 次，加入親和素?HRP，37 ℃ 條件下反應 30 min；洗板 5 次，加入顯色液 A、B，37 ℃ 條件下顯色 10 min；加入終止液；10 min 之內讀取D450 nm，計算濃度。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果用平均值±標準誤表示，統(tǒng)計分析采用SigmaPlot 12.5軟件分析，采用單因素方差分析，并用Duncan’s法對各組進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 藏豬妊娠期乳腺形態(tài)變化

乳腺HE染色結果如圖1所示，妊娠33 d時，藏豬乳腺中主要是導管結構；50 d時，乳腺中出現(xiàn)少量腺泡結構；75 d時，乳腺中腺泡結構快速增多；至90 d時，乳腺中主要是腺泡結構。

圖 1 藏豬妊娠期不同時間點乳腺形態(tài)Fig. 1 Mammary gland morphology in Tibetan pigs at different time points during gestation

2.2 藏豬妊娠期乳腺發(fā)育標志蛋白的表達

利用Western blot方法檢測了藏豬妊娠期不同時間點乳腺發(fā)育標志蛋白Elf-5和PLIN2的表達，結果發(fā)現(xiàn)，在妊娠50、75和90 d時，Elf-5蛋白表達水平顯著高于33 d；PLIN2的蛋白水平在75和90 d時顯著高于 33 d (圖 2、圖 3)。

圖 2 藏豬妊娠期不同時間點乳腺發(fā)育標志蛋白的電泳圖Fig. 2 Electropherograms of marker protein for mammary gland development at different time points during gestation in Tibetan pigs

圖 3 藏豬妊娠期不同時間點乳腺發(fā)育標志蛋白相對表達量Fig. 3 Relative expressions of marker proteins for mammary gland development at different time points during gestation in Tibetan pigs

2.3 藏豬妊娠期血清激素水平

如表1所示，妊娠期不同時間點藏豬血清中E2、P和PRL的水平隨著妊娠的進行呈升高趨勢。其中E2水平逐漸升高，到妊娠90 d達到最高水平，為 42.82 ng/L；P 水平在 75和 90 d顯著高于 33和50 d，90 d P 水平達到 36.76 μg/L；PRL 水平在 50 d升高，75 d 顯著高于 33 d 但與 50 d 無顯著差異，90d 時達到最高，為 66.53 μg/L，顯著高于其他時間點。

表 1 藏豬妊娠期不同時間點的血清激素水平1)Table 1 Serum hormone levels at different time points during gestation in Tibetan pigs

2.4 藏豬妊娠期激素受體的蛋白表達模式

利用Western blot方法檢測了藏豬妊娠期不同時間點乳腺中激素受體的蛋白表達。結果顯示，妊娠50 d時PRLR表達水平顯著高于33 d，在90 d時達到最高；ER表達水平在50 d時顯著增加，在 50、75 和 90 d 時水平相當；在 75 d 時PR 表達水平顯著高于 33 和 50 d，在 90 d 時達到更高 (圖 4、圖 5)。

圖 4 藏豬妊娠期不同時間點乳腺中激素受體電泳圖Fig. 4 Electropherograms of the hormone receptors at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

圖 5 藏豬妊娠期不同時間點乳腺中激素受體蛋白相對表達量Fig. 5 Relative expressions of the hormone receptors at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

2.5 藏豬妊娠期乳腺發(fā)育相關信號通路變化

利用Western blot方法檢測藏豬妊娠期不同時間點乳腺發(fā)育相關信號通路Jak2/STAT5和PI3K/AKT的激活情況。由圖6、圖7可知，妊娠75 d時，Jak2、STAT5、PI3k和AKT的磷酸化水平顯著升高，90 d時，Jak2、STAT5和 PI3k的磷酸化水平顯著升高，提示Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號通路被顯著激活。

圖 6 藏豬妊娠期不同時間點乳腺中Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號通路蛋白的電泳圖Fig. 6 Electropherograms of proteins from Jak2/STAT5 and PI3K/AKT signaling pathways at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

圖 7 藏豬妊娠期不同時間點乳腺中Jak2/STAT5和PI3K/AKT信號通路的蛋白相對表達量Fig. 7 Relative expressions of proteins from Jak2/STAT5 and PI3K/AKT signaling pathways at different time points during gestation in mammary glands of Tibetan pigs

3 討論與結論

3.1 藏豬妊娠期乳腺形態(tài)變化及發(fā)育標志蛋白的表達模式

妊娠期是母豬乳腺發(fā)育的重要時期。我們的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠33 d時，藏豬乳腺中主要是導管結構，50 d時出現(xiàn)少量腺泡結構，75 d時腺泡快速增多，90 d時乳腺中主要是腺泡結構。與我們的研究結果類似的是，Ji等[14]研究發(fā)現(xiàn)，母豬乳腺在妊娠45 d僅 316 g，75 d 乳腺質量達 1606 g，90 d 達到 2357 g；此外，Kensinger等[15]研究表明，母豬乳腺在90 d時，腺泡數(shù)量達到最大，在90～105 d，乳腺腺泡開始分泌并蓄積大量乳汁，泌乳活動即將開始等。高慧杰等[16]在奶山羊的妊娠前期也發(fā)現(xiàn)乳腺并沒有進入快速增殖分化階段，而是代謝和呼吸作用增強，妊娠中期有大量細胞增殖分化。

Elf-5在妊娠期和哺乳期對乳腺腺泡的增殖和分化有重要作用，是調節(jié)乳腺發(fā)育中必不可少的調控因子[17-18]。PLIN2是調控乳脂生成的關鍵分子[19]。我們的研究結果顯示，Elf-5和PLIN2在妊娠50 d后表達量顯著升高，結合乳腺的形態(tài)和Elf-5、PLIN2蛋白水平 ，說明 50 d 乳腺開始發(fā)育出腺泡，75 d 乳腺進入快速發(fā)育的階段，90 d達到更高的發(fā)育程度，其中主要是腺泡結構。

3.2 藏豬妊娠期血清激素水平、乳腺激素受體及關鍵信號通路的蛋白表達模式

妊娠期乳腺發(fā)育受到多種激素的調節(jié)，其中，E2、P是調節(jié)妊娠期乳腺發(fā)育的主要激素，PRL是調節(jié)泌乳期乳腺發(fā)育及泌乳的的主要激素[5-6]。激素通過與其受體結合發(fā)揮作用，若敲除其受體，則乳腺無法正常發(fā)育[20]。方莉莉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在牦牛的妊娠早中期，PR在乳腺組織中表達量較少，與本文藏豬妊娠早中期PR蛋白表達較少一致。本文研究結果顯示，E2、P和PRL等激素及其受體在妊娠期呈升高趨勢，與乳腺的發(fā)育程度相吻合。類似地，Horigan等[22]通過體外給卵巢切除并抑制PRL分泌的豬注射 E2、P、E2+PRL、E2+PRL+P，結果表明，注射E2+PRL+P這3種激素的組合方式才能最大程度地促進乳腺導管和腺泡產生，說明E2、P和PRL之間的相互作用對母豬乳腺發(fā)育起著關鍵作用。

PI3K/Akt和Jak2/STAT5信號通路在乳腺發(fā)育中起著重要調控作用。其中，PI3K/Akt是細胞內參與細胞信號轉導的重要通路，參與細胞生長、增殖及分化等細胞過程[9, 23]。Meng 等[10-11]研究表明，PI3K/Akt信號通路對乳腺發(fā)育和乳腺細胞的增殖具有重要作用。此外，JAK2/STAT5信號通路對乳腺腺泡的生成和多種乳汁蛋白基因的轉錄有著重要的調控作用[12-13]。我們的研究結果表明，PI3K/Akt和Jak2/STAT5信號通路在妊娠75 d后被顯著激活，這與乳腺的高度發(fā)育及泌乳活動的開始有關。Palin等[24]的研究表明，梅山豬與大白豬乳腺組織實質中STAT5A和STAT5B的表達水平存在差異，STAT5發(fā)生磷酸化后易位至細胞核，與產乳靶基因啟動子結合，激活并維持泌乳，梅山豬妊娠期乳腺組織中STAT5A和STAT5B的表達水平更高，能夠生成更多的磷酸二聚體易位至核，同時梅山豬乳腺發(fā)育情況更好，具有更高的泌乳力。

綜上所述，本文研究了藏豬妊娠期乳腺形態(tài)和乳腺發(fā)育標志蛋白、相關激素及信號通路的變化。結果發(fā)現(xiàn)，在藏豬妊娠過程中，其乳腺在妊娠50 d開始腺泡發(fā)育，75 d乳腺進入腺泡快速發(fā)育期，90 d發(fā)育程度更高，同時伴隨著血清中乳腺發(fā)育相關激素(E2、P和PRL)和乳腺中激素受體表達的顯著升高，以及乳腺發(fā)育相關通路PI3K/AKT和Jak2/STAT5的激活。研究結果為認識藏豬的乳腺發(fā)育和繁殖功能奠定了科學依據(jù)，為保護藏豬資源奠定了理論基礎。