徐丹丹，石力允，林澤勉，李依庭，姜子德，喬 方

(1 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院/深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，廣東 深圳 518055； 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

美麗崖豆藤M(fèi)illettia speciosaChamp.，又名牛大力、大力薯、山蓮藕，為豆科崖豆藤屬植物，主要分布在廣東、福建、湖南、廣西、海南、云南、貴州等省區(qū)的山谷、路旁、灌木林叢或疏林中[1]。其根部可以入藥，用來治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核等疾病，是多種中成藥的主要原料；在美麗崖豆藤生產(chǎn)地，其根部常用于制作藥膳、藥酒，其莖、芽、葉片被開發(fā)成茶包或飼料添加劑，產(chǎn)品附加值大大提升[2]。目前美麗崖豆藤野生資源已瀕臨枯竭，規(guī)模化的人工種植基地面積正逐漸擴(kuò)大。但是，鮮見關(guān)于美麗崖豆藤的病害研究[3]。

炭疽病是世界范圍內(nèi)的一種重要病害，炭疽病菌Colletotrichumspp.能夠侵染為害 3200 余種單子葉和雙子葉植物，包括園藝觀賞植物、水果、蔬菜、中藥材等[4]。在我國的豆科植物上已報(bào)道了多種炭疽病菌，如C. spaethianum引起的菜豆炭疽病[5]、C.gloeosporioides引起的葛藤和大豆炭疽病[6]、C. capsici引起的豇豆炭疽病[6]、C. chlorophyti引起的大豆炭疽病[7]、C. siamense引起的紫荊炭疽病[8]，但其鑒定所采用的標(biāo)準(zhǔn)不盡一致。即使是形態(tài)學(xué)特征和分子系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合，也有單個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer，ITS)片段、肌動(dòng)蛋白 (Actin，ACT)、3?磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、幾丁質(zhì)合成酶基因 (Chitin synthase，CHS-1)、β?微管蛋白 (βtubulin，TUB2)和鈣調(diào)蛋白 (Calmodulin，CAL)等多個(gè)基因聯(lián)合分析的區(qū)別，后者已成為炭疽病菌精準(zhǔn)鑒定的重要手段[9-10]。美麗崖豆藤炭疽病菌主要侵染葉片，在葉尖或葉緣形成大量病斑，發(fā)病后期引起大量葉片脫落，田間發(fā)病植株葉片黃化，長(zhǎng)勢(shì)衰退。為明確廣東省德慶縣美麗崖豆藤葉片炭疽病的病原菌種類及篩選有效殺菌劑，本研究采集了發(fā)病的美麗崖豆藤植株樣品，采用組織分離法獲得分離物，單孢純化后通過柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性；結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)學(xué)分析確定病原菌分類地位；同時(shí)，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定病原菌對(duì)4種常用殺菌劑的敏感性，旨在為美麗崖豆藤炭疽病的診斷和有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 癥狀觀察及樣本采集

2018年11月在廣東省肇慶市德慶縣藥材種植示范基地發(fā)現(xiàn)感染炭疽病的美麗崖豆藤，觀察并記錄病害癥狀；采集具有典型癥狀的葉片。

1.2 病原菌的分離和純化

在采集的具有典型癥狀的美麗崖豆藤葉片的病健交界處切取5 mm×5 mm的葉片組織塊，于φ為75%的乙醇溶液中浸潤(rùn)10 s進(jìn)行表面消毒，隨后用φ為2%的次氯酸鈉消毒2～3 min，再用無菌蒸餾水沖洗3次，最后于無菌濾紙上自然晾干水分。用無菌鑷子將消毒后的葉片組織塊移至倒好的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至組織塊周圍長(zhǎng)出菌絲。挑取新鮮的菌絲至新PDA平板中央進(jìn)行疑似病原菌的培養(yǎng)。待新轉(zhuǎn)移的菌落產(chǎn)生橘紅色黏孢團(tuán)后，挑取分生孢子配制孢子懸浮液，涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，于顯微鏡下切取單孢子的瓊脂塊轉(zhuǎn)移至PDA平板上，獲得單孢純化菌株。觀察各純化菌株的菌落形態(tài)，并將各菌株接種至PDA斜面試管中在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性的測(cè)定

采用菌餅接種法進(jìn)行菌株致病性測(cè)定。待培養(yǎng)菌株于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅。選取美麗崖豆藤嫩葉，用無菌接種針刺傷后接種菌餅，以接種純PDA培養(yǎng)基餅作為對(duì)照，每個(gè)菌株共計(jì)接種15張葉片。接種后的葉片置于保鮮盒中噴霧保濕，定期觀察葉片的發(fā)病情況，方法參照文獻(xiàn)[7]；隨機(jī)選取發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌的再分離，并與原接種菌株進(jìn)行形態(tài)及分子序列比較，若與原接種菌株相同，則原接種菌株即為致病菌。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃條件下的培養(yǎng)性狀；待產(chǎn)生橘紅色的黏孢團(tuán)后，用無菌牙簽挑取黏孢團(tuán)制備玻片，用Olympus BX41顯微鏡觀察各菌株形態(tài)、測(cè)定分生孢子大小。

1.5 病原菌的分子鑒定

將病原菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，刮取菌絲置于液氮下充分研磨，采用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega生物工程有限公司)提取菌絲DNA。采用引物 ITS1/ITS4[11]、CHS-79F/CHS-345R[12]、GDF/GDR[13]、ACT-512F/ACT-783R[12]和Bt2a/Bt2b[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各序列擴(kuò)增引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：DNA模板1 μL，正、反向引物各 1 μL(10 μmol/L)，2×MasterMix 12.5 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s (CHS、ACT，58 ℃；GAPDH，60 ℃；ITS、TUB2，55 ℃)退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 7 min。表2為本研究所用的刺盤孢菌株的序列信息。

取 5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后將PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司測(cè)序。將測(cè)得的基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)。下載相似性高的序列及其對(duì)應(yīng)復(fù)合種的常見模式菌株序列(各菌株均為狹義的生物學(xué)種，具體信息見表2)，使用MEGA軟件剪切后按照ITS-CHS-GAPDH-ACT-TUB2的順序首尾拼接，然后分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1000次。

表 2 刺盤孢菌株的序列信息Table 2 Sequence information of the Colletotrichum isolates

1.6 病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定

以經(jīng)致病性測(cè)定的菌株NDL13為材料，供試藥劑為苯醚甲環(huán)唑(φ為96.3%)、咪鮮胺(φ為97.0%)、吡唑醚菌酯(φ為98.0%)和甲基硫菌靈(φ為97.0%)原藥，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試藥劑對(duì)病原菌的抑制活性。首先將各藥劑溶解于甲醇中得到原液，然后加水稀釋得到工作液，取各工作液加入至PDA培養(yǎng)基中充分混勻，配制得到不同終濃度的含藥平板，以不加藥劑加入等量甲醇的PDA平板作為對(duì)照，每個(gè)藥劑濃度處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。用孔徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌餅，接種至PDA含藥平板上，置于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d，然后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落半徑，計(jì)算各殺菌劑菌絲生長(zhǎng)抑制率和抑制中濃度(EC50)，繪制毒力回歸方程。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行各處理間的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 美麗崖豆藤炭疽病的田間癥狀

美麗崖豆藤炭疽病發(fā)生于葉片，在葉尖或葉緣形成褐色的不規(guī)則形病斑，發(fā)病后期病斑變?yōu)榛野咨蚧液稚?圖1A、1B)，邊緣具有一條明顯的褐色壞死交界線(圖1C、1D)，病斑外具黃色暈圈，病斑正面有明顯的黑色小顆粒，為病原菌的分生孢子盤(圖1C)。

圖 1 美麗崖豆藤的田間發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptoms of the diseased Millettia speciose in the field

2.2 病原菌的分離、純化和致病性測(cè)定

經(jīng)過病組織分離、單孢純化及單孢菌株的菌落性狀比較，保存6個(gè)菌株，分別編號(hào)為NDL09、NDL13、NDL18、NDL19、NDL23和 NDL35。6個(gè)菌株的致病性測(cè)定結(jié)果表明，只有菌株NDL13和NDL19可引起接種葉片發(fā)病，接種3 d后葉片開始出現(xiàn)水漬狀病斑，接種8 d后病斑呈現(xiàn)為明顯的褐色壞死，中央灰白色，邊緣有黃色暈圈(圖2A～2C)，該癥狀與植株自然發(fā)病癥狀相似；對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的再分離，得到的菌株的菌絲生長(zhǎng)特征、菌落顏色、產(chǎn)孢表現(xiàn)、分生孢子顯微特征等均與接種菌株表現(xiàn)一致。PDA對(duì)照、空白對(duì)照及另外4個(gè)菌株接種的葉片均不發(fā)病，僅在傷口刺傷處有一褐色壞死點(diǎn)(圖2D～2H)。

圖 2 美麗崖豆藤葉片接種8 d后的發(fā)病癥狀Fig. 2 Disease symptoms on Millettia speciosa leaves eight days after inoculation

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

致病菌株NDL13和NDL19的形態(tài)學(xué)特征基本一致。在PDA培養(yǎng)基上，菌絲初期為白色，氣生菌絲茂盛，呈絨毛狀，菌落邊緣整齊(圖3A、3B)；培養(yǎng)15 d后菌落上出現(xiàn)橘紅色的黏孢團(tuán)(圖3C、3D)，為病原菌的分生孢子。分生孢子無色，單孢，長(zhǎng)橢圓形，兩端鈍圓，具 1～2個(gè)油球，13.46～15.45 μm×4.77～5.91 μm (圖 3E)。分生孢子萌發(fā)形成的附著孢淺棕色至黑褐色，近球形、棒形或不規(guī)則形，8.22～9.95 μm×5.46～6.29 μm(圖 3F、3G)。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合Weir等[10]的描述，初步確定該菌株屬于膠孢刺盤孢C. gloeosporioides復(fù)合種。

圖 3 炭疽病菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig. 3 Colony morphology and microscopic characters of Colletotrichum isolates

2.4 病原菌的生物信息學(xué)分析

將菌株 NDL13和 NDL19的ITS、CHS、GAPDH、ACT和TUB2這5個(gè)基因的序列與從GenBank中下載得到的21個(gè)模式菌株或公認(rèn)菌株相應(yīng)的序列進(jìn)行比對(duì)，以C. boninense為外類群構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，病原菌NDL13和NDL19均與暹羅刺盤孢C. siamense聚在一起，形成一個(gè)明顯的分支，且各分支間均有較高的支持率，因此確定美麗崖豆藤炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢C. siamense。

圖 4 基于最大似然法構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Multigene phylogenetic tree based on maximum likelihood analysis

2.5 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力

由表3可知，4種殺菌劑對(duì)美麗崖豆藤炭疽病菌均表現(xiàn)出顯著的抑制效果，EC50為0.015～0.066 mg/L。其中，咪鮮胺的抑菌效果最佳，EC50最低，為0.015 mg/L，其次為吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和甲基硫菌靈，其EC50分別為0.055、0.060和0.066 mg/L，結(jié)果表明這4種測(cè)試藥劑均可作為防治美麗崖豆藤炭疽病的首選藥劑。

表 3 4種殺菌劑對(duì)美麗崖豆藤炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果Table 3 In vitro toxicity test of four fungicides against Colletotrichum siamense

3 討論與結(jié)論

美麗崖豆藤具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，炭疽病的發(fā)生極大地影響了其產(chǎn)量和價(jià)值，本研究報(bào)道了在廣東省德慶縣藥材種植基地發(fā)現(xiàn)的美麗崖豆藤炭疽病，并結(jié)合致病性接種、形態(tài)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，將病原菌鑒定為暹羅刺盤孢C.siamense。該發(fā)現(xiàn)為美麗崖豆藤炭疽病的診斷和防治提供了理論依據(jù)。

炭疽病是一種重要的植物病害，可侵染為害植物葉片[15]、花穗[16]、果實(shí)[17]等，多年來很多學(xué)者致力于炭疽病的病原菌分類鑒定和病害防控的研究[18-19]。暹羅刺盤孢C. siamense被歸入膠孢刺盤孢C.gloeosporioides復(fù)合種，前期研究只用ITS序列對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，而該序列不能很好地區(qū)分膠胞刺盤孢復(fù)合種里面的近緣種，在后期的膠胞刺盤孢C.gloeosporioides復(fù)合種的修訂中，多基因(ITS、ACT、GAPDH、CHS-1、TUB和CAL等)聯(lián)合應(yīng)用至膠胞刺盤孢復(fù)合種的鑒定中，提升了生物種鑒定的準(zhǔn)確性[10, 20]。暹羅刺盤孢C. siamense能夠侵染多種宿主植物，如茜草科Rubiaceae的咖啡Coffea arabica[21]、天南星科Araceae的魔芋Amorphophallus konjac[22]、無患子科 Sapindaceae 的荔枝Litchi chinensis[23]、薔薇科 Rosaceae 的蘋果Malus domestica[24]、山龍眼科Proteaceae植物[25]、五加科Araliaceae的鵝掌柴Schefflera octophylla[26]、蘭科 Orchidaceae 植物[27]等。美麗崖豆藤隸屬于豆科Leguminosae崖豆藤屬M(fèi)illettia，目前鮮見刺盤孢屬Colletotrichum病原菌在崖豆藤屬植物上的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)合形態(tài)特征并構(gòu)建多基因(ITS、CHS、GAPDH、ACT和TUB2)系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定出美麗崖豆藤炭疽病的病原菌為暹羅刺盤孢C. siamense。

化學(xué)防治雖具有造成環(huán)境污染和誘使病原菌產(chǎn)生抗藥性等缺陷，但其具有高效、快速、不受地域限制、便于規(guī)?；r(nóng)事操作等優(yōu)點(diǎn)，依然是目前防治炭疽病的主要措施。藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，美麗崖豆藤炭疽病的病原菌NDL13對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑敏感，該結(jié)果與Cao等[28]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。Hu等[29]對(duì)桃子Prunus persica和藍(lán)莓Vacciniumspp.上分離得到的暹羅刺盤孢C. siamense進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 mg/L的甲基硫菌靈對(duì)其抑制率才能超過50%，遠(yuǎn)高于本研究中甲基硫菌靈對(duì)美麗崖豆藤炭疽病的病原菌暹羅刺盤孢C. siamense的EC50(0.066 mg/L)，這或與該病害為新病害，尚無進(jìn)行長(zhǎng)期的藥劑防控，病原菌對(duì)供試藥劑敏感有關(guān)，因此實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)多種藥劑輪換使用以降低病原菌的抗藥性。本研究為美麗崖豆藤炭疽病的準(zhǔn)確識(shí)別和科學(xué)防治奠定了理論基礎(chǔ)、提供了科學(xué)的指導(dǎo)建議。