梁麗瓊，黃少莉，邵 杭，王慶偉，王 鑫，王俊霞，徐領(lǐng)會(huì)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 群體微生物研究中心/廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

水稻基腐病是由玉米狄克氏菌Dickeya zeae引起的水稻重要病害之一[1-2]。該病在東南亞一些國家及中國的15個(gè)省水稻產(chǎn)區(qū)均有報(bào)道，近年來其在我國有不斷蔓延和加重的趨勢[3]，是影響我國水稻生產(chǎn)安全的潛在威脅之一。培育抗病品種和噴施化學(xué)藥劑是目前防控水稻基腐病的主要途徑。水稻細(xì)菌性基腐病的發(fā)生流行快，容易錯(cuò)過最佳防治時(shí)間，導(dǎo)致防治效果不佳[4]。同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的普遍使用和用量增加也帶來了一系列問題，包括病原細(xì)菌抗藥性增強(qiáng)和環(huán)境污染等。近年來有關(guān)生防菌防治植物病害的報(bào)道方興未艾，生防菌已成為植物病害生物防治的研究熱點(diǎn)[5]。絕大多數(shù)芽孢桿菌屬細(xì)菌是非致病菌或益生菌，其廣泛棲息在自然環(huán)境中。該屬約5%～8%的基因合成次生代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生幾十種拮抗其他病原菌的活性物質(zhì)，并具有促進(jìn)植物生長的作用[6]，有關(guān)芽孢桿菌防治水稻細(xì)菌性基腐病的研究鮮見報(bào)道。芽孢桿菌分泌的抗菌物質(zhì)主要有脂肽類化合物[7]、揮發(fā)性化合物[8]和抗菌蛋白[9]

1 材料與方法

等。研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生的 Fengycin 類和 Iturin類家族的脂肽類化合物在抑制真菌病害中起著重要作用[10]。Cho 等[11]研究表明，枯草芽胞桿菌KS03產(chǎn)生的主要抗菌化合物Iturin A 能有效抑制炭疽病菌生長，具有強(qiáng)抗真菌活性。研究表明F engycins能破壞病原真菌菌絲的超微結(jié)構(gòu)，F(xiàn)engycins 處理后，真菌細(xì)胞膜表面的張力降低，形成微孔，細(xì)胞壁遭到破壞[12-13]。Surfactin是一類強(qiáng)大的生物表面活性劑，能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[14-15]。Cawoy等[16]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌S499產(chǎn)生Surfactin的能力與其產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性物質(zhì)能力、對灰霉病Botrytis cinerea的抵御能力均呈正相關(guān)。目前有關(guān)水稻基腐病生防菌的研究報(bào)道很少，開展對解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)機(jī)理的研究可以為水稻基腐病菌的生物防治提供新的資源，為研制和發(fā)掘新型抗菌藥物提供理論基礎(chǔ)。

本研究從柑橘根際土壤中篩選和鑒定1株拮抗水稻基腐病菌Dickeya zeaeEC1生長的Bacillus amyloliquefaciensE3菌株，對其抑菌譜、生防能力、次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1.1 材料

Dickeya zeaeEC1 菌株[17]由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)群體微生物研究中心張煉輝老師課題組饋贈(zèng)。黑曲霉Aspergillus niger、黃曲霉Aspergillus flavus、茄病鐮刀菌Fusarium solani、雪腐鐮刀菌Fusarium nival、洋蔥伯克氏菌Burkholderia cenocepaciaH111、香蕉基腐病菌Dickeya zeaeMS1、柑橘潰瘍病菌Xanthomonas citripv. citri菌株jx-6、水稻基腐病菌Dickeya zeaeEC1、茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearumGMI1000、大腸埃希菌Escherichia coliDH5α均由群體微生物研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

NYD 培養(yǎng)基：牛肉膏 8 g/L，酵母提取物 3 g/L，葡萄糖 1 g/L；YPG 培養(yǎng)基：酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L；YPD 培養(yǎng)基：酵母提取物 10 g/L，胰蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L；YSB 培養(yǎng)基：蔗糖 20 g/L，酵母提取物 20 g/L，牛肉膏 15 g/L，MgSO4·7H2O 0.06 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.009 g/L；BYP 培養(yǎng)基：牛肉膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，NaCl 5 g/L；LB 培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g/L，蛋白胨 20 g/L，NaCl 20 g/L，固體培養(yǎng)基則在1 L LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加15 g瓊脂粉。

Bio-RAD C1000 Touch PCR 儀 (美國 Biorad公司生產(chǎn))，G154DWS立式壓力蒸汽滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司]，LYNX 6000大型臺(tái)式冷凍離心機(jī) (美國 Thermo 公司生產(chǎn))，Waters 2998 制備型液相色譜(美國Waters世公司生產(chǎn))，Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀 (美國 Agilent公司生產(chǎn))，色譜柱為 Durashell C18 柱 (10 mm×250 mm×5 μm)，多功能酶標(biāo)儀 (BioTek 公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 水稻基腐病菌拮抗菌株篩選D. zeaeEC1拮抗菌的篩選以水稻基腐病菌D. zeaeEC1為指示菌,該菌株全長基因組序列已在N C B I GenBank上公開，序列號(hào)為 NCBI Reference Sequence: NZ_CP006929 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP006929.1)，采用平板擴(kuò)散法篩選拮抗菌株。將D. zeaeEC1單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)至D600 nm約1.0時(shí)，以1∶100的體積比將D. zeaeEC1菌液加入約40 ℃的15 g/L的LB瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入15 mL的培養(yǎng)基，得到含D. zeaeEC1的LB固體培養(yǎng)基。

取湖南省1個(gè)柑橘園的根際土壤1 g加到10 mL無菌水中，以 28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 30 min 后，用水稀釋，稀釋梯度為 10×、100×和 1000×，取 100 μL各梯度的稀釋液涂布于已經(jīng)配制好的含有D. zeaeEC1的LB固體培養(yǎng)板上。平板風(fēng)干后放置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)48 h后，選取有抑菌圈的單菌落劃線于新的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)至長出單菌落，保存菌種用于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

挑取初篩得到的拮抗菌株單菌落，分別接種于含有200 μL LB液體培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，置于 28 ℃ 搖床振蕩培養(yǎng) 12 h 后，分別取 10 μL 菌液，加入含有D. zeaeEC1的LB固體培養(yǎng)皿中央的直徑 5 mm 的孔內(nèi)，28 ℃ 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 24 h，檢測是否有抑菌圈，并檢測其直徑大小。試驗(yàn)共篩選到產(chǎn)生抑菌圈的菌株19株，本研究選取其中抑菌圈最大，直徑約20 mm的菌株為研究對象，保存該菌株，并命名為E3。

1.2.2 E3 菌株的形態(tài)、生理生化特征測定及 16S rDNA序列分析 將菌株E3劃線到LB培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h觀察菌落形態(tài)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法參照MS(i)/C005-C01[18-19]，對菌株E3進(jìn)行生理生化檢測。測定的生化指標(biāo)包括接觸酶、苯丙氨酸脫氫酶、氧化酶活性等。

參照文獻(xiàn)[20]的方法，以E3菌株基因組DNA 為模板，選用引物 F27 (5′-AGAGTTTGATCA TGGCTCAG-3′)和 R1492 (5′-TACGGTTA CCTTGTTACGACTT-3′)，PCR 擴(kuò)增 16S rDNA 基因片段。PCR 產(chǎn)物用DNA 凝膠回收純化試劑盒純化后，委托北京擎科生物科技有限公司測序。將所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源性分析，并采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合菌落菌體形態(tài)及其生理生化特征，對E3菌株進(jìn)行分類鑒定。

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法合成2對引物Bsu-man-1F：5′-CAGGCTCACACTTTGTCTTG-3′、Bsu-man-1R：5′-TGAACACAGTCCTGGGTTAG-3′和 Bamman-1F：5′-TCGGTTT CACATCCTTCATC-3′、Bamman-1R：5′-TTTGTCAGCGTGTCTTCTG-3′。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.3 E3菌株無菌培養(yǎng)液抑菌活性最優(yōu)培養(yǎng)基的篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法，篩選抑菌物質(zhì)活性最優(yōu)的培養(yǎng)基。配制了NYD、YPG、YPD、YSB和BPY 5種培養(yǎng)基。將E3接種到含有20 mL培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 72 h。E3 培養(yǎng)液 8 000 r/min 離心 15 min，棄沉淀收集上清液，上清液用 0.2 μm的細(xì)菌過濾器過濾，吸取10 μL無菌培養(yǎng)液，采用瓊脂擴(kuò)散法測試抑菌活性，每種培養(yǎng)基重復(fù)3次，記錄抑菌圈直徑，用GraphPad繪制圖表。

1.2.4 E3 菌株無菌培養(yǎng)液對D. zeaeEC1 侵染水稻種子能力的影響 采用紙培法[23]測定E3菌株對D. zeaeEC1侵染水稻種子能力的影響。選取健康飽滿的水稻種子(‘金剛30’)，用雙蒸水沖洗4次備用。首先，準(zhǔn)備9份水稻種子，每份包含30粒種子；其中8份用于接種D. zeaeEC1并分為接種對照組(4份)和接種試驗(yàn)組(4份)，每組的4份種子進(jìn)行相同的接種程序，分別用 1.4×106、1.4×105、1.4×104和 1.4×103CFU/mL 的D. zeaeEC1 菌液浸泡，在28 ℃條件下浸泡5 h后，用無菌水沖洗種子3次；另外1份用無菌水處理作為空白對照。將這9份種子分別置于墊有3～4張濾紙(無菌水濕潤)的培養(yǎng)皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)設(shè)置參數(shù)為：晝夜溫度為 30 ℃/20 ℃，光照時(shí)間為 16 h。在保濕培養(yǎng)24 h 后，接種試驗(yàn)組的種子噴灑 2 mL 無菌 E3 培養(yǎng)液，使每一粒種子均勻覆蓋培養(yǎng)液，接種對照組和空白對照則采用相同方法用YPG培養(yǎng)基處理。置于培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)每天觀察種子萌發(fā)情況，4 d 后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，計(jì)算萌芽率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 E3菌株分泌的脂肽類物質(zhì)提取及活性測定 采用鹽酸沉淀結(jié)合丙酮抽提的方法來提取脂肽類物質(zhì)[24-25]。接種E3單菌落至500 mLYPG液體培養(yǎng)基，在 28 ℃、200 r/min 條件下，振蕩培養(yǎng) 3 d。取E3 菌株 YPG 培養(yǎng)液，于 8 000 r/min 離心 15 min后，棄沉淀，取上清液，邊攪拌邊緩慢加入HCl，調(diào)整 pH 至 2.0，4 ℃ 條件下靜置過夜。8 000 r/min 離心15 min，倒去上清液，收集沉淀物，用5倍體積的丙酮重懸后，8 000 r/min 離心 15 min，收集丙酮有機(jī)相，沉淀再次用丙酮重懸、離心，重復(fù)收集抽提液?；旌?次丙酮抽提液，放置于通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干后，得到脂肽粗提物干粉。用甲醇溶解后，采用0.2 μm的有機(jī)濾膜過濾器除菌，得到E3脂肽粗提物溶液，采用Abbkine BCA蛋白定量試劑盒測量質(zhì)量濃度。采用瓊脂擴(kuò)散法測定其抑菌活性。

1.2.6 E3菌株粗提脂肽類物質(zhì)的抑菌譜測定 參照文獻(xiàn)[26]，采用平板對峙法測定E3菌株對真菌的抑菌活性。在PDA平板上選取適當(dāng)?shù)奈恢梅胖?塊菌餅，在菌餅中間位置用5 mm的打孔器打孔，加 10 μL 粗提脂肽溶液，質(zhì)量濃度為 5583.5 μg/mL，28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d后觀測并記錄有無抑菌帶產(chǎn)生。細(xì)菌抑菌活性測試采用瓊脂擴(kuò)散法，測試粗提脂肽對大腸埃希菌、柑橘潰瘍菌、水稻基腐病菌、茄科勞爾氏菌、洋蔥伯克氏菌、香蕉基腐病菌的抑菌活性，在含有相應(yīng)病原菌的LB平板上用5 mm的打孔器打孔，加10 μL粗提脂肽溶液，質(zhì)量濃度為 5583.5 μg/mL，28 ℃ 條件下培養(yǎng)，觀察有無抑菌圈產(chǎn)生。

1.2.7 E3菌株抑菌脂肽類物質(zhì)的最小抑菌濃度(MIC)測定 挑取EC1單菌落于10 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)好的 EC1 菌液，按照1∶100的體積比接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，混勻后，取100 μL加入到96微孔板中。取100 μL 脂肽類溶液 (濃度為 5583.5 μg/mL)與微板孔的培養(yǎng)基混合均勻，梯度稀釋從20到2?12，設(shè)置僅 200 μL LB 培養(yǎng)基和 200 μL 粗提脂肽類物質(zhì)溶液為陰性對照，接種EC1的LB作為陽性對照，將96 孔板置于 28 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng) 24 h，用酶標(biāo)儀測量D600 nm，記錄數(shù)據(jù)并用GraphPad作圖。

1.2.8 E3菌株抑菌脂肽類物質(zhì)的分離純化 脂肽粗提物經(jīng)瓊脂擴(kuò)散法抗菌活性檢測后，采用半制備型高效液相色譜 (美國 Agilent 1260 Infinity I 液相色譜系統(tǒng))進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。色譜柱為C18 柱 (5 μm×10 mm×250 mm)，流動(dòng)相 A：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，B：乙腈；等梯度洗脫：V(A)∶V(B) = 20∶80；檢測波長：UV 200～400 nm，流速：3 mL/min。每 5 min收集 1 管，共收集 8 個(gè)組分，濃縮后進(jìn)行抑菌活性測定。

1.2.9 E3 菌株抑菌活性物質(zhì)的鑒定 ESI-MS 技術(shù)是分析脂肽化合物復(fù)合體中各組分的相對分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)的有效工具。對于相對分子質(zhì)量小于1 000的小分子，ESI-MS技術(shù)會(huì)產(chǎn)生[M+H]+或[M?H]?離子，選擇相應(yīng)的正離子或負(fù)離子形式進(jìn)行檢測，就可得到其相對分子質(zhì)量[27]。本研究采用Thermo UPLC-Q Exactive Focus Orbitrap 液相質(zhì)譜聯(lián)用分析儀進(jìn)行LC-ESI-MS分析，色譜檢測條件：色譜柱：Waters HSS T3 柱 (2.1 mm × 100 mm ×1.8 μm)；流速 0.3 mL/min，溶劑：流動(dòng)相 A 為純水(加體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫程序?yàn)椋?～15 min: 80%～100% B，15～20 min: 100%B。質(zhì)譜檢測條件：離子源：H-ESI, 噴霧電壓 4.0 kV，鞘氣流速：40 psi，輔氣流速：10 psi，離子傳輸管溫度：320 ℃；電離模式：Positive；全掃描模式，掃描范圍m/z：850～2000。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻基腐病菌拮抗菌株的鑒定

采用平板抑菌法從湖南柑橘果園根際土壤中分離、篩選拮抗水稻基腐病菌生長的細(xì)菌，共篩選到19個(gè)菌株，其中，E3菌株抑菌圈直徑最大，達(dá)20 mm，因此選其作為研究對象。E3菌株在LB平板劃線，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d后，菌落呈白色不透明、圓形、邊緣不整齊，呈鋸齒狀、表面干燥、有褶皺(圖1)。對該菌株進(jìn)行生理生化分析(表1)發(fā)現(xiàn)，E3菌株接觸酶、V-P試驗(yàn)和硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，耐高鹽，適宜生長的pH范圍為5.7～6.8，可以利用檸檬酸和酪蛋白作為能量來源，并能夠降解淀粉、明膠和酪素。

圖 1 E3菌落形態(tài)圖Fig. 1 Colony morphology of strain E3

表 1 水稻基腐病菌拮抗菌 E3菌株的主要生理生化特性Table 1 The main physiological and biochemical characteristics of Bacillus amyloliquefaciens E3 strain

對E3菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行相似性分析以及構(gòu)建菌株親緣關(guān)系發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與已公布的Bacillus amyloliquefacies(GenBank 登錄號(hào)為MN756640.1)親緣關(guān)系最近(圖2)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)E3菌株基因組DNA可以擴(kuò)增解淀粉芽胞桿菌而不是枯草芽孢菌特異的β-甘露聚糖酶基因片段(圖3)。根據(jù)菌株的菌落表型、生理生化特征，結(jié)合16S rDNA 序列分析和特異擴(kuò)增解淀粉芽胞桿菌β-甘露聚糖酶基因片段結(jié)果，確定菌株E3為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens，并將該菌株命名為B. amyloliquefaciensE3，16S rDNA 序列已提交至NCBI，GenBank登錄號(hào)為MW130122。該菌株于2017年12月7日保藏于中國武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC No：M 2017768。

圖 2 依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的E3菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree of E3 strain based on 16S rDNA sequence

圖 3 β-甘露聚糖酶基因序列特異性擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig. 3 The electrophoresis results of specific amplification of β-mannanase gene sequence

2.2 B. amyloliquefaciens E3培養(yǎng)液產(chǎn)抑菌活性的最優(yōu)培養(yǎng)基

芽孢桿菌可以分泌多種抗菌活性物質(zhì)到胞外拮抗其他微生物的生長，而拮抗物質(zhì)的表達(dá)分泌受外界環(huán)境條件的誘導(dǎo)和影響[28]。為確定E3產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基，通過比較E3無菌培養(yǎng)液抑菌圈的大小，從5種常用培養(yǎng)基中篩選了E3產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)最多的培養(yǎng)基(圖4)。從圖4可以看出，在營養(yǎng)豐富的YPG培養(yǎng)基中，E3菌株無菌培養(yǎng)液的抑菌圈最大，表明其分泌到胞外的抑菌活性物質(zhì)最多，故選擇YPG培養(yǎng)基培養(yǎng)E3菌株提取抗菌活性物質(zhì)。

圖 4 以無細(xì)胞上清液的抗菌活性為指標(biāo)的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 Results of medium optimization based on the antibacterial activity of cell-free supernatant

2.3 B. amyloliquefaciens E3降低D. zeae EC1對萌發(fā)種子的侵染能力

在水稻種子的萌發(fā)階段，水稻基腐病菌D. zeaeEC1可以成功侵染，造成種子萌芽腐爛，使種子萌芽率降低，甚至完全不萌發(fā)[29]。本研究開展了無菌E3培養(yǎng)液拮抗D. zeaeEC1侵染水稻種子的防效試驗(yàn)，以確定E3菌株是否可以降低D. zeaeEC1對萌發(fā)種子的侵染能力。水稻種子接種不同劑量的D.zeaeEC1，同時(shí)設(shè)置無菌水處理種子為空白對照；每一個(gè)濃度處理的試驗(yàn)組種子與無菌E3培養(yǎng)液混勻，而對照組則與等量YPG培養(yǎng)基混勻；種子置于晝夜溫度分別為30、20 ℃的培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)4 d后，比較試驗(yàn)組與對照組的萌芽率。由圖5可以看出，與空白對照相比，接種了1.4×105和1.4×104CFU/mL 的D. zeaeEC1 對照組種子萌芽率分別降低至20.0%和37.8%，而同時(shí)接種了無菌E3培養(yǎng)液對應(yīng)劑量的試驗(yàn)組種子，萌芽率則大大提高，分別達(dá)到63.3%和85.6%，這表明無菌E3培養(yǎng)液可以顯著降低D. zeaeEC1抑制水稻種子萌發(fā)的能力。這些結(jié)果表明E3菌株分泌到胞外的抗菌物質(zhì)可以部分拮抗水稻基腐細(xì)菌D. zeaeEC1抑制水稻種子萌發(fā)的能力。

圖 5 Bacillus amyloliquefacions E3菌株無菌培養(yǎng)液對Dickeya zeae EC1抑制水稻種子萌芽率的拮抗效果Fig. 5 Antagonism effect of the sterile culture medium of Bacillus amyloliquefaciens E3 strain on the inhibition of rice seeds germination by Dickeya zeae EC1

2.4 B. amyloliquefaciens E3抑菌活性物質(zhì)及最小抑菌濃度(MIC)

采用鹽酸沉淀后丙酮抽提的方法，提取E3無菌培養(yǎng)液中的脂肽類物質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒測得脂肽粗提物質(zhì)量濃度為5583.9 mg/mL。對脂肽粗提物進(jìn)行抑菌活性測定，以無菌培養(yǎng)液為陽性對照，以甲醇作為陰性對照，抑菌效果如圖6所示。從圖6可以看出，脂肽粗提物和無菌培養(yǎng)液均具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對照甲醇沒有活性，表明E3的抑菌活性物質(zhì)主要為脂肽類物質(zhì)。

圖 6 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株粗提脂肽的抑菌活性Fig. 6 Antimicrobial activity of crude lipopeptides extracted from Bacillus amyloliquefaciens E3 strain

為了測定E3抑菌脂肽粗提物的MIC, 將粗提脂肽(5583.5 μg/mL)以2的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋從20到 2?12，與等量的D. zeaeEC1 混合加入 96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，振蕩共培養(yǎng)24 h后利用酶標(biāo)儀測定D600 nm。由圖7可以看出，E3粗提脂肽質(zhì)量濃度由1.36 μg/mL升到 174.48 μg/mL 時(shí)，D600 nm與陽性對照 (0 μg/mL+EC1)無顯著差異，表明其不能抑制D. zeaeEC1的生長；而當(dāng)濃度升高到348.97 μg/mL及以上時(shí)，D600 nm與陰性對照(LB培養(yǎng)基)無顯著差異，表明其幾乎完全抑制了D. zeaeEC1的生長。陰性對照LB培養(yǎng)基D600 nm為0，說明LB不存在其他微生物的污染。這些結(jié)果表明E3脂肽粗提物可以有效抑制D. zeaeEC1 的生長，最小抑菌濃度為 348.97 μg/mL。

圖 7 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株脂肽粗提物對Dickeya zeae EC1的抑制作用Fig. 7 Inhibitory effect of crude lipopeptides extracted from Bacillus amyloliquefaciens E3 strain against Dickeya zeae EC1

2.5 B. amyloliquefaciens E3抑菌活性物質(zhì)抑菌譜

采用平板對峙法檢測E3菌株對真菌的拮抗作用，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測E3菌株對細(xì)菌的拮抗作用。結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn)，除了抑制水稻基腐病菌D. zeaeEC1的生長外，E3脂肽粗提物也拮抗茄病鐮刀菌、香蕉基腐病菌、柑橘潰瘍病菌、茄科勞爾氏菌和大腸埃希菌的生長，但是對黑曲霉、黃曲霉、雪腐鐮刀菌和洋蔥伯克氏菌的生長則沒有任何抑制作用。由此可見，B. amyloliquefaciensE3粗提脂肽類物質(zhì)對多種植物細(xì)菌和真菌都有一定的抑制作用，具有廣譜的抑菌活性。

圖 8 Bacillus amyloliquefaciens E3菌株的抗真菌譜Fig. 8 The antimicrobial spectrum of strain Bacillus amyloliquefaciens E3 strain

2.6 B. amyloliquefaciens E3抑菌活性物質(zhì)的HPLC分離純化結(jié)果

為了進(jìn)一步分離鑒定 E3分泌的拮抗D. zeaeEC1的主要抑菌活性物質(zhì)的化學(xué)成分，將E3脂肽粗提物用高效液相色譜柱C18柱進(jìn)行分離, 按時(shí)間收集各餾分，每5 min收集1管，共得到8個(gè)餾分，采用瓊脂擴(kuò)散法分別檢測這8個(gè)餾分的抑菌活性。根據(jù)抑菌圈的大小來判斷，發(fā)現(xiàn)餾分2 (5～10 min)和餾分5 (20～25 min)具有抗菌活性，而且抑菌活性成分主要集中在餾分5 (圖9)。將餾分2和餾分5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，進(jìn)行下一步的LC-MS分析。

圖 9 HPLC 純化分離抑菌物質(zhì)各餾分活性檢測圖Fig. 9 Determination of antibacterial activity of each fraction isolated and purified by HPLC

2.7 B. amyloliquefaciens E3抑菌活性物質(zhì)的LCESI-MS鑒定結(jié)果

收集具有抗菌活性的餾分2和餾分5，用LCESI-MS鑒定各餾分的主要化學(xué)成分(圖10)。餾分2中檢測到主要的分子離子峰[M+H]+為1435.77、1449.79、1463.80、1477.82 和 1491.83，相對分子質(zhì)量相差14，恰好是一個(gè)亞甲基—CH2的相對分子質(zhì)量。通過對比抗菌脂肽類化合物的理論相對分子質(zhì)量，可以推測該組物質(zhì)屬于Fengycin類化合物(圖10B)。在分析活性餾分5的質(zhì)譜圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，其主要的分子離子峰 [M+H]+為 994.64、1008.66、1022.67、1036.69 和 1050.70，與脂肽物質(zhì)Surfactin的相對分子質(zhì)量相吻合，據(jù)此推斷該組物質(zhì)為Surfactin類化合物或者其同系物(圖10D)；另外餾分 5 還發(fā)現(xiàn)了 [M+H]+為 1058.67、1072.69、1086.70，它們屬于 C15～C17 的 Iturin B 類化合物的質(zhì)子加合峰。脂肽類抗生素質(zhì)譜峰的分析參考陳華等[27]和 Vater等[30]研究。

圖 10 餾分2和餾分5 的HPLC-ESI-MS分析Fig. 10 HPLC-ESI-MS analysis of fraction 2 and 5

根據(jù)以上質(zhì)譜分析結(jié)果判斷，餾分2的主要抑菌物質(zhì)包括Fengycin A和Fengycin B，餾分5的主要抑菌物質(zhì)包括Surfactin和Iturin類化合物。由此可以推斷，B. amyloliquefaciensE3產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)為Fengycin、Surfactin和Iturin 3種脂肽類抗生素，且餾分5鑒定的Surfactin可能起主要的抑菌活性。至于是否還有其他的抑菌活性物質(zhì)，還需進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。

3 討論與結(jié)論

眾多研究表明，許多根際土壤分離的微生物是根際促生菌 (Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，這類微生物在適應(yīng)環(huán)境生長過程中分泌多種具有生物活性的次生代謝物，具有抗菌、競爭性抑制病原菌生長或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等作用，有效拮抗病原菌的侵染，并能促進(jìn)植物生長，可以作為生防菌防治植物病害，因而受到植物病理學(xué)家的廣泛重視[31-32]。近年來，有關(guān)分離及鑒定根際促生菌并將其用于防治植物病害的研究日趨廣泛和深入，逐漸成為生物防治領(lǐng)域的有效途徑[33]。芽孢桿菌屬Bacillus細(xì)菌是一種典型的根際促生菌，抗逆性強(qiáng)，能產(chǎn)生環(huán)狀脂肽、聚酮類、揮發(fā)性化合物和抗菌肽等多種抑菌活性物質(zhì)，具有很好的生防應(yīng)用潛力[34]。解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensFZB42是研究最深入的根際促生菌模式菌株，具有廣譜抗性，已經(jīng)在農(nóng)業(yè)上廣泛用于防治番茄、棉花、草莓和馬鈴薯等多種植物病害[35]。眾多研究表明芽孢桿菌分泌的環(huán)狀脂肽Surfactin、Fengycin 和Iturin不僅拮抗鐮刀菌Fusarium、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、海棗曲霉菌Aspergillus phoenicis、禾草離蠕孢菌Bipolaris sorokiniana等多種植物病原真菌生長，還具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的功能。Chowdhury等[36]研究表明，解淀粉芽孢桿菌 FZB42能夠產(chǎn)生 Surfactin、Fengycin 和 Bacillomycin D，抑制立枯絲核菌的生長，在生菜遇到病原菌侵染時(shí)還能夠介導(dǎo)植株產(chǎn)生防御性反應(yīng)；向亞萍等[37]從解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensB1619菌株發(fā)酵物中分離出3種脂肽類抗生素，其中，Bacillomycin L 和Fengycin是抑制番茄枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici生長的主要物質(zhì)。Surfactin可以抑制丁香假單胞菌Pseudomonas syringae和多種黃單胞菌Xanthomonas等病原菌的生長[38]。Zeriouh等[39]發(fā)現(xiàn)2株枯草芽孢桿菌B. subtilisUMAF6614和UMAF6639 可以拮抗黃單胞菌Xanthomonas campestris pv.cucurbitae和果膠桿菌Pectobacterium carotovorumsubsp.生長，主要抑菌活性成分為Iturin。Cao等[40]分離得到貝萊斯芽孢桿菌B. velezensisY6 菌株，并發(fā)現(xiàn)該菌株分泌的Fengycin和Surfactin是抑制細(xì)菌性青枯菌Ralstonia solanacearum生長的主要物質(zhì)，而Iturin則是抑制尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum孢子萌發(fā)的主要物質(zhì)。這些研究進(jìn)展表明脂肽類物質(zhì)在生物防治病原細(xì)菌方面有巨大的潛力。

玉米狄克氏細(xì)菌Dickeya zeae，異名為菊花歐文氏菌Erwinia chrysanthemipv.zeae，除感染水稻引起水稻基腐病外，還侵染玉米、馬鈴薯、香蕉等多種雙子葉和單子葉植物，引起莖腐病和軟腐病等多種細(xì)菌性病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Hadizadeh 等[41]發(fā)現(xiàn)黏性沙雷氏菌Serratia plymuthicaA3菌株可以拮抗Dickeya solani生長，可減輕馬鈴薯在低溫貯藏過程中軟腐病發(fā)病率，以及田間栽培過程中病原菌從母薯向子薯的傳播。Chen 等[42]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensD2WM菌株能夠抑制引起軟腐病的D. chrysanthemi生長，并發(fā)現(xiàn)多酮類化合物 Macrolactin為其主要抑菌活性物質(zhì)。Li等[43]篩選并鑒定了對Dickeya zeae有拮抗作用的3個(gè)菌株P(guān)seudomonas fluorescensSC3、P. parafulvaSC11 和B. velezensis3-10，室內(nèi)接種試驗(yàn)表明3個(gè)菌株均具有作為生防菌的潛力。本研究從柑橘根際土壤中篩選到1株拮抗水稻基腐菌的B. amyloliquefaciens菌株，鑒定并命名為E3。研究發(fā)現(xiàn)該菌株培養(yǎng)液可以有效降低水稻基腐病菌對水稻種子的侵染能力，其分泌的Surfactin、Fengycin和Iturin 3種脂肽類物質(zhì)為主要抑菌活性成分。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了解淀粉芽孢菌拮抗植物病原細(xì)菌的資源庫，也為防治水稻基腐病尋找安全、環(huán)保新型生物農(nóng)藥提供了新的依據(jù)。