趙慎非,黃莉莉,黃鳴清,張怡評,林思榮,邱遠(yuǎn)望

(1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350001；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；3.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心,福建 廈門 361005；4.福建中益制藥有限公司，福建 石獅 362712)

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌器官，其分泌的甲狀腺素是人體生長發(fā)育和新陳代謝不可缺少的激素[1]。甲狀腺腫是臨床上常見的甲狀腺疾病，是由于甲狀腺上皮細(xì)胞增生而形成的甲狀腺腫大，以頸前喉結(jié)兩旁結(jié)塊腫大為主要特征，女性顯著高發(fā)，高發(fā)年齡為20～50歲，嚴(yán)重影響了患者的生活和工作[2]。甲狀腺腫大的原因主要有碘攝入不足、甲狀腺腫瘤等甲狀腺疾病誘發(fā)、藥物或食物導(dǎo)致甲狀腺激素合成障礙[3]。其臨床治療多采用手術(shù)治療，術(shù)后長期服用左甲狀腺素鈉，但伴有諸多不良反應(yīng)，復(fù)發(fā)率較高。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，甲狀腺腫在中醫(yī)學(xué)中屬“氣癭”范疇，其多因情志內(nèi)傷、飲食及水土失宜，以致肝郁日久，氣機(jī)不暢，津液凝聚成痰，痰氣交阻，結(jié)于頸部而成。傳統(tǒng)中醫(yī)藥對該病的治療具有悠久歷史，其治療原則為理氣化痰、軟堅散結(jié)、活血化瘀[4]。昆布散為中醫(yī)經(jīng)典方劑，收錄于宋代《圣濟(jì)總錄》，由昆布、海藻、松蘿、海蛤、木通、白蘞、桂枝組成，主治氣癭初結(jié)，現(xiàn)代臨床常用于治療甲狀腺腫大，療效確切。然而，目前尚缺乏昆布散抗甲狀腺腫大相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)數(shù)據(jù)，無法對其臨床推廣及新藥開發(fā)提供指導(dǎo)作用。因此，本研究通過建立丙硫氧嘧啶所致大鼠甲狀腺腫大模型，深入探討昆布散對大鼠甲狀腺腫大的治療作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性Wistar大鼠(180～200 g)72只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度45%～55%，飲水與飼料充足，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施許可證號：SYXK(閩)2019-0007。本研究的動物實(shí)驗(yàn)操作符合動物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 藥物及試劑 昆布散藥液：取處方量昆布30 g、海藻30 g、松蘿10 g、海蛤20 g、木通20 g、白蘞20 g、桂枝20 g，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮實(shí)驗(yàn)所需濃度。丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號：208936)，使用時以生理鹽水配制為1 mg·mL-1溶液。左甲狀腺素鈉片(德國默克公司，批號：199818)，使用時以生理鹽水配制為2 μg·mL-1溶液。

三碘甲狀腺原氨酸(T3)試劑盒(批號：H222)、甲狀腺素(T4)試劑盒(批號：H223)、促甲狀腺激素(TSH)試劑盒(批號：H087)，均購自南京建成生物工程研究所。Keap1(4678S)、HO-1(43966)、β-actin(3700)，購自美國CST公司；NQO-1(ab28947)、兔二抗、鼠二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 儀器 XY2000C電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)、SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司)、Infinite 200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)、ChemiDoc XRS+ 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、Micro17R臺式高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛公司)。

2 方法

2.1 造模方法與分組給藥 除正常對照(Sham)組大鼠外，其余大鼠隨機(jī)分為模型組(Model)、左甲狀腺素鈉組(LTS)、昆布散低劑量組(KBS-L)、昆布散中劑量組(KBS-M)、昆布散高劑量組(KBS-H)(n=12)，每天灌服丙硫氧嘧啶溶液(10 mL·kg-1)1次，連續(xù)造模14 d。造模成功后，空白組和模型組每天灌服等量的生理鹽水，LTS組按20 μg·kg-1體重灌服左甲狀腺素鈉片溶液，KBS-L、KBS-M、KBS-H組分別按每千體重5.87、11.56、23.14 g生藥灌服昆布散藥液，灌胃體積均為10 mL·kg-1，連續(xù)給藥28 d。每周稱重1次，以調(diào)整給藥量。

2.2 樣本采集及指標(biāo)檢測 末次給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3～5 mL，以3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，采用放射免疫法測定大鼠血清中T3、T4、TSH水平。

處死動物后，迅速取出甲狀腺，電子天平稱濕重，計算甲狀腺系數(shù)(甲狀腺系數(shù)=甲狀腺重量mg/大鼠體重g×100)。

各組隨機(jī)選取6份甲狀腺，根據(jù)其重量加入適量預(yù)冷的PBS，研磨均勻，制成10%的甲狀腺組織勻漿液，采用比色法測定大鼠甲狀腺組織中MDA、SOD水平。

2.3 Western Blot檢測大鼠甲狀腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá) 選取各組剩余6份甲狀腺，稱重后切成碎塊放入勻漿器，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，在冰上充分研磨裂解后，4 ℃離心10 min，上清即為蛋白提取液，用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。將制備好的蛋白樣品于100 ℃變性10 min，冷卻至室溫后用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，上樣總量為30 μg。電泳結(jié)束后，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗滌、孵育二抗，洗滌后用化學(xué)發(fā)光法檢測各組樣品Keap1、HO-1、NQO-1蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，用Image Lab 6.0分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 昆布散對大鼠甲狀腺濕重、甲狀腺系數(shù)的影響 連續(xù)給藥28 d后，與正常組比較，模型組大鼠的甲狀腺濕重和甲狀腺系數(shù)明顯增大(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組大鼠的甲狀腺濕重和甲狀腺系數(shù)均有所降低，但差異未見顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 昆布散對大鼠甲狀腺濕重、甲狀腺系數(shù)的影響

3.2 昆布散對大鼠血清甲狀腺激素水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中T3、T4水平顯著降低(P<0.01)，TSH水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，左甲狀腺素鈉組和昆布散中、高劑量組大鼠血清中T3、T4水平顯著升高(P<0.01)，TSH水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；昆布散低劑量組大鼠血清中各指標(biāo)均有所改變，但差異未見顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 昆布散對大鼠血清中T3、T4、TSH水平的影響

3.3 昆布散對大鼠甲狀腺組織中SOD、MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中SOD水平明顯下降(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，左甲狀腺素鈉組和昆布散各劑量組SOD水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)(見表3)。

表3 昆布散對大鼠甲狀腺組織MDA、SOD水平的影響

3.4 昆布散對大鼠甲狀腺Keap1、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中Keap1蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，昆布散低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織中Keap1蛋白表達(dá)水平明顯降低增高(P<0.01)，而HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)水平則明顯增高(P<0.01)，且呈一定劑量依賴性；左甲狀腺素鈉組則表現(xiàn)出與昆布散各劑量相似的藥理效應(yīng)(P<0.01)。

Sham：正常組；Model：模型組；LTS：左甲狀腺素鈉組；KBS-L：昆布散低劑量組；KBS-M：昆布散中劑量組；KBS-H：昆布散高劑量組

4 討論

甲狀腺腫大是由于多種原因?qū)е碌募谞钕袤w積或形態(tài)變大，目前以手術(shù)和藥物治療為主的治療方式存在諸多不足[5]。甲狀腺的主要功能是合成甲狀腺激素，其中T4、T3具生物學(xué)活性，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境；而TSH參與調(diào)節(jié)促甲狀腺激素分泌，其水平升高時表示甲狀腺激素分泌不足[6]。本實(shí)驗(yàn)利用丙硫氧嘧啶作為造模藥，其原理是抑制甲狀腺內(nèi)過氧化物酶系統(tǒng)，阻斷甲狀腺中酪氨酸的碘化和碘化酪氨酸的縮合，從而抑制甲狀腺激素的合成。結(jié)果表明，與正常大鼠相比，模型大鼠血清T4、T3水平明顯降低，TSH水平明顯升高；而昆布散治療則顯著上調(diào)模型大鼠T4、T3水平，降低TSH水平，表明昆布散可明顯改善甲狀腺腫大大鼠的甲狀腺功能。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生過度氧化應(yīng)激損傷時，會生成過多ROS，抗氧化系統(tǒng)不足以及時抗衡，還會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，催化裂解產(chǎn)生毒性醛基產(chǎn)物MDA[7]。而SOD是體內(nèi)的自由基清除劑之一，可有效降低胞內(nèi)ROS水平，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，昆布散可明顯上調(diào)模型大鼠甲狀腺SOD水平，降低MDA含量，提示昆布散可促進(jìn)甲狀腺腫大大鼠甲狀腺內(nèi)氧自由基的清除，并抑制脂質(zhì)過氧化。研究表明，Keap1/HO-1/NQO-1通路是甲狀腺中氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要發(fā)生途徑之一[8-9]。Keap1敲除后的甲狀腺濾泡細(xì)胞系中NQO-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低[10]；HO-1作為血紅素分解代謝過程中的限速酶，在細(xì)胞中發(fā)揮抗氧化、抗炎的特性[11]，其下游的NQO-1可參與調(diào)節(jié)胞質(zhì)氧化還原狀態(tài)，從而發(fā)揮維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，昆布散可明顯降低模型大鼠甲狀腺Keap1蛋白表達(dá)，升高HO-1和NQO-1的蛋白表達(dá)。綜上，昆布散可能通過抑制甲狀腺腫大大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)來改善甲狀腺功能，其機(jī)制可能與調(diào)控Keap1/HO-1/NQO-1通路有關(guān)。