白青山，田朋鑫

(臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000)

頭孢泊肟酯是第3代口服頭孢菌素,對成人和兒童的各種細菌性感染疾病均有較好療效[1-2]。頭孢泊肟酯生產(chǎn)過程中使用了甲醇、乙醇等有機溶劑，可能會與工藝中使用的鹽酸反應生成基因毒性雜質(zhì)氯甲烷和氯乙烷。該類雜質(zhì)的反應活性很活潑，可以直接與DNA發(fā)生烷基化反應[3]，從而抑制細胞生長，啟動程序性細胞凋亡[4-5]。此類雜質(zhì)雖微量，但依然可能產(chǎn)生致癌風險，因此需要嚴格控制[6-7]。目前關于頭孢泊肟酯的含量測定、有關物質(zhì)以及溶劑殘留的研究已有較多文獻報道[8-11]，但尚未有針對頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷測定的研究。因此，探索頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的定量分析方法是對其檢驗標準的進一步完善探討。本文旨在建立一種操作簡單、準確度高的頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的測定方法，為其用藥安全及相關研究提供一個新的思路和實驗基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司)，配QP2010PLUS質(zhì)譜檢測器，GCMS Solution工作站。

1.2 試劑 氯甲烷對照品(TCI，批號：U3VTF，含量：5.6%,W/W)；氯乙烷對照品(TCI，批號：8GAYA，含量：15.1%，W/W)；氯丙烷對照品(TCI，批號：62R4N-GA，含量：99.0%)；N,N-二甲基甲酰胺(色譜級，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；頭孢泊肟酯(SR有限公司，批號：1902028001、1903028001、1903028002)。

2 方法與結果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 (6%-氰丙基苯基)-94%甲基聚硅氧烷為固定液(MEGA，MEGA-624MS，60 m×0.25 mm，1.4 μm)的毛細管柱；程序升溫過程：初始柱溫為40 ℃維持9 min，以50 ℃·min-1速率升溫至230 ℃，維持7 min；進樣口溫度：250 ℃；載氣為氦氣；流速為線速度模式，柱流速2 mL·min-1；分流進樣，分流比10∶1；頂空瓶平衡溫度80 ℃，定量環(huán)溫度110 ℃，傳輸管線溫度120 ℃，平衡時間25 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊電離源(EI)，離子源溫度：200 ℃，接口溫度：200 ℃，檢測離子(m/z)為50、64、78。

2.2 溶液配制

2.2.1 氯甲烷、氯乙烷貯備溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷對照品各1 mL置500 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻；精密量取25 mL置100 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 內(nèi)標貯備溶液 精密稱取氯丙烷對照品104.58 mg，置25 mL量瓶中，用50%DMF溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL置50 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 內(nèi)標溶液 精密量取內(nèi)標貯備溶液5 mL置100 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺溶液定量稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 對照品溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷貯備溶液3 mL置100 mL量瓶中，加內(nèi)標貯備溶液5 mL，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 供試品溶液 取頭孢泊肟酯原料約15 mg(以頭孢泊肟計)，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入內(nèi)標溶液1 mL，立即加蓋密封，輕輕振搖溶解，搖勻，即得。

2.2.6 供試品混合溶液 取頭孢泊肟酯原料約15 mg(以頭孢泊肟計)，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入對照品溶液1 mL，立即加蓋密封，輕輕振搖溶解，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗 精密量取50%DMF溶液1 mL，置20 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，作為專屬性空白溶劑。取空白溶劑、定位溶液、內(nèi)標溶液、供試品溶液、供試品混合溶液依次頂空進樣，記錄色譜圖，氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷保留時間分別為3.472、4.573、5.972 min；供試品混合溶液(見圖 1)中各組分分離度良好，專屬性符合可接受標準。

圖1 供試品混合溶液的GC-MS圖

2.4 線性關系試驗 線性關系試驗溶液：分別精密量取“2.2.1”項下的氯甲烷、氯乙烷貯備溶液1、2、3、4、5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”項下的內(nèi)標貯備溶液，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取各溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，即得線性關系試驗溶液1、2、3、4、5。

取上述溶液分別頂空進樣，以待測物濃度C(μg·mL-1)為橫坐標，以氯甲烷峰和氯乙烷峰與內(nèi)標峰峰面積的比值為縱坐標，作圖，氯甲烷和氯乙烷標準曲線回歸方程分別為Y=0.384 5C+0.004 865，r=0.999 1；Y=1.038C-0.001 799，r=0.999 7。該結果表明氯甲烷和氯乙烷分別在0.252 5～1.263 μg·mL-1和0.645 1～3.226 μg·mL-1范圍內(nèi)濃度與峰面積比值成良好的線性關系。

2.5 檢測限及定量限 取氯甲烷、氯乙烷對照品適量，加50%DMF溶液溶解并稀釋至所需濃度，依法測定，檢測限以信噪比S/N為2～3計；定量限以信噪比S/N為10計；定量限溶液連續(xù)測定6次，檢測限溶液測定1次。通過試驗確定氯甲烷定量限濃度為0.040 40 ng·mL-1，檢測限濃度為0.016 16 ng·mL-1；氯乙烷定量限濃度為0.103 2 ng·mL-1，檢測限濃度為0.041 29 ng·mL-1。氯甲烷定量限保留時間RSD為0.04%，峰面積RSD為3.2%；氯乙烷定量限保留時間RSD為0.05%，峰面積RSD為5.2%。

2.6 準確度試驗 準確度貯備溶液：分別精密量取“2.2.1”項下的氯甲烷、氯乙烷貯備溶液1、3、4.5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”項下的內(nèi)標貯備溶液，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得準確度貯備溶液#1、#2、#3。

準確度供試品溶液：取頭孢泊肟酯原料12份，每份約15 mg(以頭孢泊肟計)，精密稱定，置12個20 mL頂空瓶中，其中3份各加入 “2.2.3”項下的內(nèi)標溶液1 mL溶解，作為空白供試品溶液，空白供試品溶液中未檢出氯甲烷和氯乙烷。其余的9份樣品分3組，每組各3份，分別加準確度貯備溶液#1、#2、#3 1 mL溶解，依次進樣測定，用內(nèi)標法計算加樣回收率，氯甲烷和氯乙烷的回收率均在 80%～115%之間，符合可接受標準。結果見表1～2。

表1 氯甲烷準確度試驗結果(n=9)

表2 氯乙烷準確度試驗結果(n=9)

2.7 系統(tǒng)精密度試驗 取“2.4”項下線性關系溶液3頂空進樣，記錄色譜圖，連續(xù)測定6次，計算氯甲烷峰和氯乙烷峰與內(nèi)標峰峰面積的比值的RSD，結果氯甲烷響應值RSD為0.7%，氯乙烷響應值RSD為0.6%，表明精密度良好。

2.8 重復性試驗 取頭孢泊肟酯原料，按照“2.2.7”項下供試品混合溶液的制備方法平行制備6份，依法測定，記錄色譜圖。結果氯甲烷回收率平均值為98.6%，RSD為2.4%；氯乙烷回收率平均值為100.2%，RSD為0.9%，表明重復性良好。

2.9 樣品檢測 取3批頭孢泊肟酯原料，按“2.2.6”項下的方法制備供試品溶液，依法檢測，結果均未檢出氯甲烷和氯乙烷。

3 討論與結論

3.1 頂空條件的選擇 取“2.2.5”項下的定位溶液于頂空溫度78、80、82 ℃，頂空時間20、25、30 min下進行頂空條件考察，結果發(fā)現(xiàn)氯甲烷、氯乙烷在頂空溫度78、80、82 ℃，頂空時間20、25、30 min與內(nèi)標溶液的峰面積比值均相差不大，故選擇頂空溫度80 ℃，頂空時間25 min。

3.2 限度的制定 頭孢泊肟酯屬于抗感染治療用藥物，其藥品說明書中規(guī)定的每日最大使用劑量為0.8 g，ICH 2017年3月發(fā)布的M7(R1)指導原則《評估和控制藥物中DNA反應性(突變性)雜質(zhì)以限制潛在致癌風險》中氯甲烷、氯乙烷的TD50值分別為每天1 361、1 810 mg·kg-1[12],通過計算可得每日允許暴露量PDE值分別為每天1 361、1 810 μg。根據(jù)ICH Q3A(R2)中對于雜質(zhì)限度的規(guī)定，我們初步將頭孢泊肟酯原料藥及其制劑中氯甲烷、氯乙烷的限度值定為0.1%。

藥品中的很多雜質(zhì)都能夠產(chǎn)生毒副作用，尤其是基因毒性雜質(zhì)，極少的暴露量就能夠?qū)θ梭w健康產(chǎn)生嚴重的危害[12]。頭孢泊肟酯原料藥在《中國藥典》中有收載，但未見對氯甲烷和氯乙烷的控制，本文建立的GC-MS法分析速度快、靈敏度高、定量準確，適合頭孢泊肟酯原料藥中氯甲烷和氯乙烷的測定，該研究為頭孢泊肟酯的質(zhì)量優(yōu)化提供了參考依據(jù)。