◎ 陳 燕，李康柏，許均圖，陳德斌，洪瑞申，王 景

（華鑫檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510642）

抗生素在預(yù)防和治療感染性疾病、促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)、日常保健等過程中作出了很大貢獻(xiàn)。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素作為飼料添加劑和防腐劑廣泛應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)。但過量使用抗生素會(huì)產(chǎn)生食品安全問題和生物環(huán)境問題[1]。目前，國(guó)家對(duì)抗生素用法和用量列入日常監(jiān)測(cè)范圍。已有檢測(cè)方法主要是食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)通用，本研究方法在原有食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于SPE-LC-MS/MS的磺胺類[2]、四環(huán)素類[3]、喹諾酮類[4]、大環(huán)內(nèi)酯類[5]以及氯霉素類[6-7]等17種抗生素藥物殘留量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

Agilent 1260液相色譜，Agilent 6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，氮吹儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，渦旋振蕩器。

阿莫西林、青霉素G、氟甲喹、土霉素、四環(huán)素、金霉素、甲氧芐啶（TMP）、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、紅霉素、羅紅霉素、氯霉素和氟苯尼考，磺胺二甲嘧啶-13C6，恩諾沙星-D5、青霉素G-D7、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈均為色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為mili-Q超純水。PEP固相萃取小柱（200 mg/6 mL）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

17種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱取適量樣品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。于-20 ℃下保存。脫水紅霉素溶液由紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：向紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入適量稀硫酸，常溫下振蕩4 h，用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，定容，于4 ℃下保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)需要配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下保存，當(dāng)天使用。

1.3 儀器工作參數(shù)

1.3.1 色譜條件

Agilent Poroshell EC-C18液相色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈。流速：0.5 mL·min-1。洗脫程序：0.0 min 10% B，7.0～9.0 min 95% B，9.1 min 10% B。進(jìn)樣量：20 μL。負(fù)離子模式為流動(dòng)相A：水，流動(dòng)相B：乙腈。流速：0.5 mL·min-1。流動(dòng)相比例為A∶B=4∶6。

1.3.2 質(zhì)譜條件

（1）Agilent 6470的質(zhì)譜條件。電噴霧負(fù)電離源（ESI+）；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速6 L·min-1；霧化器壓力0.276 MPa；毛細(xì)管電壓4 000 V；鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速 12 L·min-1；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

（2）負(fù)離子模式條件。電噴霧負(fù)電離源（ESI-）；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速6 L·min-1；霧化器壓力0.276 MPa；毛細(xì)管電壓2 500 V；鞘氣溫度 300 ℃，鞘氣流速 12 L·min-1；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。MRM優(yōu)化后的檢測(cè)條件見表1。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式監(jiān)測(cè)17種抗生素的部分質(zhì)譜參數(shù)表

1.4 測(cè)定步驟

1.4.1 樣品預(yù)處理

樣品去皮、骨、內(nèi)臟后取可食部分，切碎勻漿，于冰箱4 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 提取

稱取5.0 g樣品，加入100 μL內(nèi)標(biāo)液，加入乙二胺四乙酸（EDTA）使之濃度為0.01 mol·L-1，用80%乙腈溶液提取。PEP SPE小柱（200 mg/6 mL）用6 mL超純水活化平衡，上樣富集，上樣后用10 mL超純水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，氮?dú)獯蹈珊笥? mL甲醇洗脫，洗脫液在45 ℃下水浴氮吹至近干，加入1 mL 5%甲醇水溶液溶解殘?jiān)?，過0.2 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法檢出限及回收率

四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，其他抗生素采用相應(yīng)類別的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。水產(chǎn)品中17種抗生素的回收率在61%～115%。采用目標(biāo)化合物的母離子和特征子離子為選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)（MRM），結(jié)合化合物不同的保留時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，17種抗生素10 ng·mL-1的提取MRM譜圖如圖1所示。17種抗生素的回收率和檢出限如表2所示。

表2 17種抗生素的回收率和檢出限表

圖1 17種抗生素10 ng·mL-1的提取MRM譜圖

3 結(jié)論

本文建立了一種水產(chǎn)品中抗生素的高通量檢測(cè)方法，檢測(cè)藥物類別涵蓋磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類以及氯霉素類等17種抗生素。該方法前處理較為簡(jiǎn)單，回收率、檢出限滿足水產(chǎn)品質(zhì)量安全常規(guī)檢測(cè)需求。