◎ 胡淑青

（從化海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東 廣州 510900）

實驗室質(zhì)量控制方式主要分為外部質(zhì)量控制和內(nèi)部質(zhì)量控制兩大類。參加能力驗證活動是認可實驗室開展外部質(zhì)量控制的重要方式之一，可直觀顯示參試實驗室的技術(shù)能力，幫助參試實驗室及時發(fā)現(xiàn)潛在問題并及時采取糾正或預(yù)防措施，進而提高實驗室運行管理的能力與信心。

沙門氏菌屬（Salmonella）分類屬腸桿菌科，是一類分布廣泛、血清型較多、抗原復(fù)雜的腸道病原菌[1]，可引起人類的傷寒、副傷寒、感染性腹瀉、食物中毒和醫(yī)院內(nèi)感染，并引起動物發(fā)生沙門氏菌病[2]。引起沙門氏菌中毒的食品主要是肉類、蛋類和乳類，日本則以魚類為多，我國以肉類食品為主，主要是牛肉、豬肉和馬肉[3]。

從化海關(guān)綜合實驗室常年承擔(dān)的食品法定檢驗及社會委托檢驗中，沙門氏菌是微生物檢驗的常檢項目。實驗室于2020年8月參加廣州海關(guān)技術(shù)中心組織的“IQTC20B12食品中沙門氏菌的檢驗”能力驗證項目。根據(jù)國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）[4]對兩樣品進行檢驗，最終獲得滿意的結(jié)果評價。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

兩待測樣品編號分別為PT082和PT126，為西林瓶密封裝的菌株凍干粉，由廣州海關(guān)技術(shù)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）顆粒培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）平板和EasyID沙門氏菌生化鑒定盒，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。沙門氏菌診斷血清（A-F），購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 參考標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.4 儀器設(shè)備

MDF-192N超低溫冰箱（日本SANYO）；HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋（日本HIRAYAMA）；GI7-2生化培養(yǎng)箱（美國SHEL LAB）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO）；Mili-Q Direct 16超純水機（美國MILLIPORE）。

1.5 方法

1.5.1 樣品處理及預(yù)增菌

從超低溫冰箱（-80 ℃）取出待測樣品，靜置至室溫。西林瓶內(nèi)含奶粉為基質(zhì)的凍干粉，在生物安全柜內(nèi)無菌操作開啟西林瓶，加入5 mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，用無菌吸管轉(zhuǎn)移樣品液體至盛有225 mL滅菌BPW的錐形瓶中，隨后每次5 mL分4次用滅菌生理鹽水潤洗西林瓶后將清洗液回收至上述錐形瓶中。編號PT082和編號PT126樣品分別處理后做好編號標(biāo)記。同樣方式接種鼠傷寒沙門氏菌做陽性對照。

將預(yù)處理后的編號分別為PT082和PT126的錐形瓶置于生化培養(yǎng)箱（36 ℃）培養(yǎng)18 h。

1.5.2 增菌

輕搖PT082、PT126和對照組的BPW培養(yǎng)物，各移取1 mL，分別轉(zhuǎn)于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液，輕輕搖勻。SC置于生化培養(yǎng)箱（36 ℃）培養(yǎng)22 h，TTB置于生化培養(yǎng)箱（42 ℃）培養(yǎng)22 h。

1.5.3 選擇性分離

輕搖增菌液，將其分別劃線接種于BS平板、XLD平板、HE平板和沙門氏菌屬顯色平板。接種后的XLD平板、HE平板和沙門氏菌屬顯色平板置于生化培養(yǎng)箱（36 ℃）培養(yǎng)24 h，BS平板培養(yǎng)48 h。

1.5.4 生化試驗

對照國標(biāo)，自選擇性平板上挑取典型或可疑菌落，接種三糖鐵（TSI）瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，無需換新接種環(huán)，繼續(xù)接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂（NA）平板，置于生化培養(yǎng)箱（36 ℃）培養(yǎng)24 h。

對照國標(biāo)，對初步生化試驗結(jié)果判斷為可疑沙門氏菌屬的菌落使用EasyID沙門氏菌生化鑒定盒進行鑒定。

1.5.5 血清學(xué)鑒定

將步驟1.5.4符合沙門氏菌屬生化反應(yīng)特性的菌落進行血清凝集試驗。在無菌培養(yǎng)皿上滴加1滴沙門氏菌診斷血清（A-F），用無菌接種環(huán)挑取單菌落于診斷血清中輕輕攪拌勻，觀察是否有顆粒狀的凝集現(xiàn)象。同時用生理鹽水作對照排除菌落自凝可能性。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性分離結(jié)果

各選擇性平板的菌落特征見表1。對照國家標(biāo)準(zhǔn)，觀察到編號PT082樣品在SC增菌液以及編號PT126樣品在TTB增菌液分別劃線接種的培養(yǎng)物在選擇性平板的菌落形態(tài)特征疑似沙門氏菌。同時，觀察到編號PT082樣品在TTB增菌液以及編號PT126樣品在SC增菌液分別劃線接種的培養(yǎng)物在選擇性平板的菌落形態(tài)特征與沙門氏菌的菌落特征相似度不大。

表1 選擇性瓊脂平板上菌落形態(tài)表

2.2 初步生化試驗結(jié)果

樣品初步生化試驗結(jié)果見表2。其中，XLD（PT082，SC）表示編號PT082樣品在SC增菌液劃線接種的XLD平板；BS（PT126，TTB）表示PT126樣品在TTB增菌液劃線接種的BS平板；HE（PT126，SC）表示編號PT126樣品在SC增菌液劃線接種的HE平板；沙門氏菌屬顯色平板（對照，TTB）表示陽性對照品在TTB增菌液劃線接種的沙門氏菌屬顯色平板。對照國家標(biāo)準(zhǔn)，初步判斷樣品PT082和樣品PT126為可疑沙門氏菌屬。

表2 樣品初步生化試驗結(jié)果表

2.3 全面生化鑒定結(jié)果

樣品全面生化試驗結(jié)果見表3。

表3 樣品全面生化試驗結(jié)果表

2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果

樣品血清學(xué)鑒定結(jié)果見表4。對照國標(biāo)，綜合表1～表4，可判定本次能力驗證兩樣品（PT082和PT126）均檢出沙門氏菌。

表4 樣品血清學(xué)鑒定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

采用傳統(tǒng)國標(biāo)方法檢驗沙門氏菌，耗時較長但方法成熟，仍是目前較為通用的檢驗方法。利用BPW預(yù)增菌，可以使沙門氏菌得到一定的增殖，提高陽性檢出率。在實際檢驗中，對于未加工的生鮮食品或污染較嚴(yán)重的樣品，可使用SC增菌液和TTB增菌液直接增菌。在選擇性瓊脂平板的選擇上，國標(biāo)法顯示BS平板是必需，再另選XLD平板、HE平板、顯色平板其中之一搭配使用。BS平板較之于上述3種平板培養(yǎng)時間較長，一般需要培養(yǎng)48 h，在實際檢驗中，建議選用3種或以上選擇性平板分離培養(yǎng)細菌。特異性和靈敏度較強的顯色培養(yǎng)基推薦使用，可輔助提高檢驗效率。

國標(biāo)法顯示，初步生化試驗中利用三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基反應(yīng)結(jié)果首先排除非沙門氏菌的可能性。三糖鐵瓊脂因含有乳糖、蔗糖和葡萄糖3種糖（比例為10∶10∶1）而得名。只能利用葡萄糖的細菌，分解葡萄糖產(chǎn)酸使斜面先變黃，但因葡萄糖量少，生產(chǎn)的少量酸因接觸空氣而氧化。斜面葡萄糖被分解完，蛋白胨繼而被細菌利用從而產(chǎn)堿，故斜面由黃變?yōu)樯罴t（通過酚紅指示劑顯示）。瓊脂底部處于缺氧狀態(tài)，酸類物質(zhì)難以揮發(fā)，因此保持黃色。三糖鐵變黑原因在于某些細菌能夠?qū)⒘虼蛩徕c還原為硫化氫，硫化氫與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化亞鐵。樣品HE（PT126，SC）的三糖鐵瓊脂反應(yīng)結(jié)果為A/A，產(chǎn)氣（+），產(chǎn)硫化氫（-），配合賴氨酸試驗陰性結(jié)果，可判斷此細菌為非沙門氏菌。最后補充說明，三糖鐵瓊脂斜面可以自制亦可選用生物公司生產(chǎn)的即用型，自制斜面選用試管塞加塞試管方式，帶微孔的試管塞可讓細菌培養(yǎng)時候較為均勻利用空氣成分呼吸代謝；而即用型斜面多采用旋鈕蓋子加蓋玻璃瓶子方式（由于生產(chǎn)滅菌流程及運輸儲存需要），因此在培養(yǎng)過程中，建議旋上蓋子七八成松緊度，既可以令細菌利用糖類代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)及氣體緩慢揮發(fā)，亦可避免蓋子旋緊度不夠情況下，某些細菌利用糖類大量產(chǎn)酸產(chǎn)氣導(dǎo)致空間內(nèi)氣壓過高將蓋子沖出。

本次能力驗證實驗最后一步血清學(xué)鑒定，用沙門氏菌O多價血清（A～F）進行凝集分群（95%以上的沙門氏菌屬屬于A～F群），只鑒定到屬。回看國標(biāo)，沙門氏菌血清型分型是選做項目，需要進一步利用O因子血清將可疑菌鑒定到群，再用H因子血清第一相（特異相）定型，最后用H因子第二相（非特異相）輔助定型。沙門氏菌屬在電鏡下觀察形態(tài)相似，可是基于其表面的O抗原和H抗原的不同組合卻能分出許多血清型。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）資料顯示，超過2 500種沙門氏菌血清型已被區(qū)分并命名，但由于眾多血清型都非常罕有，科學(xué)家們對其了解尚不深入[5]。

本次能力驗證報告兩樣品均檢出沙門氏菌，獲得組織方的滿意評價。參加能力驗證活動，可以夯實實驗室技術(shù)能力，對于參試實驗人員而言，亦是一次很好的實踐機會。